高分辨率熔解曲线法在GLP1R基因多态性位点rs3765467检测中的应用Δ

张 远，何 霞，钟 磊，串俊兰，龙恩武（四川省医学科学院/四川省人民医院药学部，成都 610072）

·精准医疗·

高分辨率熔解曲线法在GLP1R基因多态性位点rs3765467检测中的应用Δ

张 远＊，何 霞，钟 磊，串俊兰，龙恩武#（四川省医学科学院/四川省人民医院药学部，成都 610072）

目的：建立检测肠促胰岛素样肽-1受体（GLP1R）基因已知突变位点rs3765467（NT_007592.16的第39 065 819位）的方法，并评价其准确性与实用性。方法：收集我院体检中心2015年10月－2016年2月72例健康体检者的外周静脉血样本，采用柱提法提取其全血DNA，经降落聚合酶链反应扩增后，采用高分辨率熔解曲线（HRM）法对产物进行分析；同时选取其中38例受试样本进行双脱氧链终止法（Sanger测序法）测序验证，比较2种方法的结果。结果：突变扫描结果显示，扩增片段中存在39 065 817和39 065 819两个多态性位点。HRM法只检测出了4种基因型[GCG/GCG、GCA/GCG或ACG/GCG、GCA/GCA或ACG/ACG、A（G）CA（G）]；而Sanger测序法共检测出6种基因型[GCG/GCG、ACG/GCG、ACG/ACG、A（G）CA（G）、GCA/GCG、GCA/GCA]。结论：HRM法可区分GCG/GCG和A（G）CA（G）基因型，但无法区分GCA/GCG与ACG/GCG杂合突变、GCA/GCA与ACG/ACG纯合突变。该方法并不适用于多个邻近位点的单核苷酸多态性检测。在进行单核苷酸突变检测时，应对序列进行综合分析后再选取经济、简便的方法。

GLP1R基因；高分辨率熔解曲线；单核苷酸多态性；基因检测

肠促胰岛素效应是指口服葡萄糖对胰岛素分泌的促进作用明显强于静脉注射的现象。该效应所产生的胰岛素占进食后胰岛素总量的60%左右，且有研究发现，这种肠促胰岛素效应在2型糖尿患者中有所减退，因此，基于肠促胰岛素样肽1（Glucagon-like peptide 1，GLP-1）作用机制的药物应运而生，为2型糖尿病的治疗开辟了新的途径[1]。GLP-1由肠道L细胞分泌，与胰岛B细胞表面GLP-1受体（Glucagon-like peptide 1 receptor，GLP1R）结合后，通过G蛋白偶联途径调控胰岛素的分泌[2]。近几年有研究发现，2型糖尿病患者虽然餐后GLP-1水平未见改变，但胰岛素分泌功能却明显受损；此外，一些2型糖尿病患者对外源性GLP-1刺激不敏感，提示可能与GLP1R功能异常有关[3-4]。Sathananthan A等[4]发现，GLP1R基因多态性位点rs3765467（NT_ 007592.16的第39 065 819位）可显著影响健康人输注GLP-1后胰岛B细胞的应答，故在2型糖尿病患者中检测该多态性位点可能有助于阐明个体差异的原因和指导疾病治疗。

高分辨率熔解曲线（High resolution melting，HRM）是近年来国内外兴起的一种灵敏度高、特异性好、通量高、检测成本低、快速、方便的单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism，SNP）检测方法。该方法通过在DNA双链中嵌入饱和染料、监控DNA熔解曲线的变化来进行分析，不仅可检测已知突变位点，还可以同时扫描目标片段中的未知突变位点[5]。本研究通过建立GLP1R基因多态性位点rs3765467（G＞A）的HRM分析方法，对72例健康受试者进行该突变位点的检测及其前后共68 bp片段的突变扫描，并采用双脱氧链终止法（Sanger测序法）对其中38例样本进行验证，评价HRM法用于SNP检测的准确性与实用性。

1 资料与方法

1.1 研究对象

收集我院体检中心2015年10月－2016年2月72例健康体检者的外周静脉血样本。其中，男性48例，平均年龄（52.00±5.27）岁；女性24例，平均年龄（50.79± 6.01）岁。所有标本的采集均获得医院医学伦理委员会的批准，所有受试者均知情同意。

1.2 DNA的提取

采用柱提法提取受试者的全血DNA。所有受试者均采集静脉血1～2 mL，经乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝后，采用柱式全血基因组提取试剂盒（上海百傲科技股份有限公司）提取全血DNA。采用NanoDrop 2000型超微量分光光度计（美国Thermo公司）测得其DNA质量浓度为40～120 ng/μL；以不同波长下光密度（OD）比值计算其纯度分别为1.6～2.0（OD260nm/OD280nm）、1.7～2.2（OD260nm/OD230nm）。

1.3 引物合成

根据美国国立生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）人类GLP1R的参考序列NT_007592.16，设计针对rs3765467（G＞A）突变位点的上、下游引物，详见表1。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，并采用高效液相色谱（HPLC）法纯化。

表1 GLP1R基因多态性位点rs3765467的引物序列Tab 1 Primer sequences for GLP1R gene polymorphism site rs3765467

1.4 扩增及HRM分析

扩增及HRM分析均在Light Cycler 480型实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）仪（罗氏诊断）中完成，试剂盒采用预混有Taq酶、dNTP、高分辨率熔解染料的Light Cycler 480 HRM试剂盒（罗氏诊断）。

采用降落PCR法对受试者全血DNA进行扩增。扩增体系共20 μL，包括2 ng DNA模版、150 nmol/L引物、1.5 μmol/L Mg2+。PCR反应条件：95℃预变性10 min，95℃扩增10 s；随后，退火温度由66℃降至58℃，保持10 s，每1℃为1个循环，延迟2个循环开始，共扩增50个循环；72℃再延伸10 s。扩增产物长度为109 bp。

HRM反应条件：95℃熔解1 min，降至40℃保持90 s，以0.04℃/s的速率从75℃上升到95℃，完成熔解曲线分析，探测次数为15次/℃。采用Light Cycler 480基因扫描软件（R 1.5.1.62）（罗氏诊断），设置“温度偏移（Temperature shift）”一栏下的“温度变化水平（Threshold）”为0，其他参数为默认，每个待测样本均设置复孔，进行扫描与分析。

1.5 Sanger测序

为进一步验证HRM法检测结果，从各基因型样本中随机抽取7～13例样本，共38例，采用Sanger测序法进行验证。该试验交由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

2 结果

2.1 HRM法的检测结果

突变扫描结果显示，扩增片段中存在39 065 817和39 065 819两个多态性位点，共检出基因型4种。其中，野生型（GCG/GCG）23例，杂合型（GCA/GCG或ACG/ GCG）28例，突变型（GCA/GCA或ACG/ACG）11例，多位点突变型[A（G）CA（G）]10例，详见图1、图2（因涉及两个位点的突变，故为明确表达，结果均采用NT_ 007592.16第39 065 817～39 065 819位的3个碱基表示）。序列第39 065 817位也存在G＞A的突变，而HRM法无法区分这两个位点间的杂合突变（GCA/GCG和ACG/GCG）和纯合突变（GCA/GCA和ACG/ACG）。

图1 样本标化熔解曲线Fig 1 The normalized melting curves of samples

图2 样本差异作图Fig 2 The difference plot for samples

2.2 Sanger测序法的检测结果

共检出基因型6种。其中，GCG/GCG型14例，ACG/GCG型2例，ACG/ACG型1例，A（G）CA（G）型9例，GCA/GCG型6例，GCA/GCA型6例，详见图3。由于HRM法无法区分5′-ACG-3′与5′-GCA-3′的纯合和杂合型，故无法判断HRM法的检测结果是否与Sanger测序一致，但HRM法能够区分GCG/GCG与A（G）CA（G）这两种基因型，其检测结果与Sanger测序是一致的。

图3 GLP1R rs3765467位点的Sanger测序图Fig 3 Sanger sequencing for GLP1R rs3765467

3 讨论

在倡导精准医疗的大背景下，基于遗传多态性的个体化用药被越来越多的医务工作者所重视。现有多种SNP筛查技术如测序、DNA芯片、Tagman探针、突变扩增阻滞系统（Amplification refractory mutation system，ARMS）等已逐渐应用于临床检测，并已覆盖到心脑血管疾病、精神类疾病及肿瘤等方面[6-7]。本研究通过检测GLP1R基因中的已知SNP位点，探讨HRM法用于突变检测的优缺点，为使用该技术的同行提供参考。

PCR-HRM的分析原理是在普通PCR的基础上加入可与双链DNA结合的饱和荧光染料，扩增结束后采取逐步升温的过程将产物解链，荧光染料因此脱落，荧光信号逐渐减弱，形成一个随温度升高而荧光信号减弱的曲线图（如图1）。当50%的双链解链成单链时所对应的温度称为熔解温度（Tm），由于各片段的碱基（GC）含量不同，所对应的Tm也有所不同。HRM法至少可分辨0.5℃Tm的差异，其精密的温控设计使单个碱基的突变（一般是C/T或G/A突变分辨效果较好）分型成为可能[5]。

由于HRM法不需要设计探针，且PCR扩增过程完成后只需运行一个升温程序即可完成检测，因此具有成本低、简便、闭管操作等优势。但在有些情况下（比如C＞G、A＞T突变，突变基因丰度很低，或待测位点邻近区域有其他突变碱基），则需进行条件优化，优化方法包括：掺杂一定比例的野生型样本、使用低变性温度下共扩增PCR或设计多重PCR及各式探针等[8-10]。虽然这些方法可以扩大HRM法的检测范围，但探针引物的设计及PCR反应体系的探索更耗时、耗力，甚至有时候需要在扩增后进行开管操作，难以体现HRM法成本低、简便等特点。

本研究共检测了72例样本，为避免人力、物力不必要的浪费，根据统计学理论和Janavicius R等[11]的对比研究，抽取了超过16例样本（本研究抽取的38例样本）进行验证[12]，采用的方法为基因检测的“金标准”——Sanger测序法（检测成本高）。验证结果显示，与HRM法只检出了4种基因型比较，Sanger测序法共检出了6种基因型，表明HRM法的分辨率不如Sanger测序法高。其原因可能为：本研究的待测位点邻近区域恰巧也存在1个G＞A的突变，使得包括待测位点在内的3个碱基呈对称排列[5′-GCG-3′（野生型）或5′-ACA-3′（突变型）]，这种排列造成5′-ACG-3′与5′-GCA-3′的纯合型（ACG/ACG和GCA/GCA）和杂合型（ACG/GCG和GCA/GCG）无法被区分。因此对于此类位点的检测，HRM法也许不是一个适当的选择。Tindall EA等[13]和Chen C等[14]在各自的研究中也得出与本研究一致的结论，即当待测片段中含有多个SNP位点时会影响HRM法分析结果的准确性。

综上所述，当检测范围有2个以上邻近突变位点时不宜采用HRM法；若是对突变片段进行扫描，必须结合测序结果才能作出准确判定，否则会影响结果的准确性。如此一来，HRM法成本低、简便等优势也许就不那么明显了。本研究为HRM法直接检测SNP位点提供了一定的方法学参考，但如何全面地评价HRM法在SNP检测中的应用地位还需要参考更多的方法，如加入探针或改变试验条件，或与Taqman探针、DNA芯片等检测方法进行比对，以及进行经济学方面的比较等。

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Application of High Resolution Melting Method in the Detection of GLP1R Gene Polymorphism Site rs3765467

OBJECTIVE：To establish the method for the detection of the known glucagon-like peptide 1 receptor（GLP1R）gene mutation site rs3765467（NT_007592.16，position：39 065 819），and to evaluate its accuracy and practicability.METHODS：Peripheral venous blood samples of 72 healthy subjects were collected in medical examination center of our hospital during Oct. 2015-Feb.2016.The whole blood DNA was extracted by column extraction method.After amplified by touch down PCR，high resolution melting（HRM）method was adopted to analyze amplified product.Sequencing verification by double stranded chain termination method（Sanger sequencing method）was performed for 38 test samples.The results of 2 methods were compared.RESULTS：The results of mutation scanning showed that there were 39 065 817 and 39 065 819 polymorphism sites in amplified segments. Four types of mutations were detected by HRM method[GCG/GCG，GCA/GCG or ACG/GCG，GCA/GCA or ACG/ACG，A（G）CA（G）]，but 6 types of mutations was detected by Sanger sequencing method[GCG/GCG，ACG/GCG，ACG/ACG，A（G）CA（G），GCA/GCG，GCA/GCA].CONCLUSIONS：HRM method can identify GCG/GCG and A（G）CA（G）genotype，but can not identify GCA/GCG and ACG/GCG heterozygous mutation，GCA/GCA and ACG/ACG homozygous mutation.The method is not suitable for the detection of single nucleotide polymorphism for multiple neighboring sites.In the detection of single nucleotide mutation，economical and simple method should be selected after comprehensive analysis of sequence.

GLP1R gene；High resolution melting；Single nucleotide polymorphism；Gene detection

R394

A

1001-0408（2017）17-2305-04

2016-08-08

2017-02-07）

（编辑：张元媛）

四川省科技支撑计划项目（No.2015SZ0182）

＊主管药师，硕士。研究方向：药物基因组学。电话：028-87393405。E-mail：447415054@qq.com

#通信作者：副主任药师。研究方向：内分泌临床药学、药事管理学、药物经济学评价。电话：028-87393316。E-mail：dragon984169@ 126.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.17.01

ZHANG Yuan，HE Xia，ZHONG Lei，CHUAN Junlan，LONG Enwu（Dept.of Pharmacy，Sichuan Academy of Medical Sciences/Sichuan Provincial People’s Hospital，Chengdu 610072，China）