白术七物颗粒剂对气阴两虚型慢传输型便秘模型大鼠结肠组织c-kit的影响及其作用机制

林仁敬，鲁海燕*，何永恒，聂 晶

·论著·

·中医·中西医结合研究·

白术七物颗粒剂对气阴两虚型慢传输型便秘模型大鼠结肠组织c-kit的影响及其作用机制

林仁敬1，鲁海燕1*，何永恒1，聂 晶2

目的 研究白术七物颗粒剂对气阴两虚型慢传输型便秘(STC)模型大鼠结肠组织c-kit的影响，探讨其可能作用机制。方法 2015年9—11月，将70只SPF级SD大鼠随机分成空白组20只、模型组50只，雌雄各半。模型组大鼠皮下注射盐酸吗啡注射液2.5 mg/kg，空白组注射等量0.9%氯化钠溶液，1次/d，连续注射45 d。模型组大鼠皮下注射盐酸吗啡注射液15 d后，灌服(青皮、枳壳、附子，剂量13 g/kg)，连续30 d，建立气阴两虚型STC大鼠模型。模型建立成功后，将模型组剩下的40只大鼠随机分为模型对照组，白术七物颗粒高、低剂量组和莫沙必利组，每组10只，雌雄各半。除空白组、模型对照组外，白术七物颗粒高、低剂量组和莫沙必利组给予相应的药物灌胃。应用RT-PCR、免疫组化法检测白术七物颗粒剂对气阴两虚型STC模型大鼠结肠组织c-kit影响。结果 模型组样本大鼠肠道推进率低于空白组样本(P<0.05)。白术七物颗粒低剂量组、白术七物颗粒高剂量组、莫沙必利组大鼠小肠推进率高于模型对照组(P<0.05)。白术七物颗粒高剂量组、莫沙必利组c-kit mRNA表达水平高于模型对照组(P<0.05)。白术七物颗粒低剂量组c-kit mRNA表达水平低于白术七物颗粒高剂量组(P<0.05)。白术七物颗粒高剂量组、莫沙必利组c-kit表达水平高于模型对照组(P<0.05)。结论 白术七物颗粒剂治疗气阴两虚型STC模型大鼠的作用机制是通过增加结肠组织中c-kit表达水平来实现的。

便秘；气阴两虚；大鼠；c-kit

林仁敬，鲁海燕，何永恒，等.白术七物颗粒剂对气阴两虚型慢传输型便秘模型大鼠结肠组织c-kit的影响及其作用机制[J].中国全科医学，2017，20(21)：2640-2643,2648.[www.chinagp.net]

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慢传输型便秘(STC)属于功能性便秘，主要表现为排便次数减少，便意减弱甚至消失并伴有腹胀，约占慢性便秘的42.0%[1]。目前该病发病机制尚不清楚，症状顽固，病程较长，近年来的研究热点主要集中在探讨STC的发病机制及有效治疗方面。

白术七物颗粒剂为本院何永恒教授的专利方(专利号201210057943.9)，广泛应用于STC的临床治疗，疗效显著[2]。本研究旨在探讨白术七物颗粒剂对气阴两虚型STC模型大鼠结肠组织c-kit水平的影响及其作用机制，为STC的中药治疗提供了实验依据及理论参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物 2015年9—11月，SD大鼠70只，SPF级，雌雄各半，体质量180～220 g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供。动物合格证编号：NO.43004700017298。饲养于湖南斯莱克景达实验动物有限公司动物实验中心SPF级实验室，温度20～26 ℃，相对湿度40%～70%。适应实验环境3 d后，随机分为两组：空白组20只、模型组50只，雌雄各半。造模45 d后在两组各随机抽取10只作为观察样本，验证STC模型是否成功，再将模型组剩下的40只大鼠随机分为模型对照组,白术七物颗粒高、低剂量组，莫沙必利组，每组10只，雌雄各半。

1.2 实验药品及试剂 盐酸吗啡注射液(东北制药集团沈阳第一制药有限公司，1 ml∶10 mg，批号：20150105)，白术七物颗粒剂(药物组成：槟榔、沉香、木香、乌药、生白术、生地黄、升麻，湖南中医药大学第二附属医院提供,全方生药量125 g)，中药颗粒剂(药物组成：青皮、枳壳、附子，湖南中医药大学第二附属医院提供，生药量51 g)，枸橼酸莫沙必利片(成都康弘药业集团股份有限公司，批号：150413)。Trizol试剂(BIOMIGA)；焦碳酸二乙酯(DEPC，Amresco)；SYBR Green qRCR Mix、反转录试剂盒(GeneCopoeia)；c-kit一抗、二抗，DAB(北京博奥森生物科技有限公司)。

1.3 实验器材 与参考文献[3]相同。

1.4 实验方法 造模方法：造模组50只大鼠皮下注射盐酸吗啡注射液2.5 mg·kg-1·d-1，空白组20只大鼠皮下注射等量0.9%氯化钠溶液，连续注射45 d。造模组50只大鼠皮下注射盐酸吗啡注射液15 d后，灌服中药颗粒剂溶液13 g/kg，1次/d，连续30 d，建立气阴两虚型[4]STC大鼠模型。造模组、空白组大鼠粪便每日称重并记录，采用Bristol粪便性状评分(BSFS)[5]观察各组大鼠粪便性状，STC大鼠的粪便性状改变标准：分离的硬团状或团块状粪便；正常大鼠的粪便性状：香肠状或团块状光滑软便。造模成功后观察10只样本大鼠一般体征变化；计算大鼠肠道推进率〔造模45 d后在空白组、模型组各随机抽取10只作为观察样本，禁食不禁水24 h，10%活性炭悬液2 ml灌胃30 min后颈椎脱臼处死。剖腹取出直肠末端到幽门的全部肠道，摆正拉直，在无张力状态下测量肠道全长和墨汁在肠道的推进距离，计算墨汁推进距离占肠道全长的百分比并进行统计分析。肠道推进率(%)=墨汁推进距离(cm)/肠道全长(cm)×100%〕。气阴两虚型STC大鼠模型成功标准：造模组大鼠粪便质量明显减小，造模组大鼠肠道推进率较正常组降低且有统计学差异，则认为造模各组大鼠肠道传输功能降低，符合STC的临床诊断标准，造模成功。

1.5 给药方法 造模成功后，停药7 d，白术七物颗粒高、低剂量组、莫沙必利组给予相应药物灌胃，给药体积10 ml/kg；模型对照组、空白组给予等量0.9%氯化钠溶液灌胃；1次/d，14 d为1个疗程。根据大鼠体表面积换算，白术七物颗粒低、高剂量组分别予白术七物颗粒10.5 g生药/kg、21.0 g生药/kg；莫沙必利组给予莫沙必利2.5 mg/kg。

1.6 标本采集 各组停止灌胃1周后，均禁食不禁水24 h，10%活性炭悬液2 ml灌胃30 min后颈椎脱臼处死。立即剖腹，取结肠组织4 cm，分成两段，一段用于RT-PCR检测c-kit mRNA表达水平；一段用于免疫组化法观察c-kit 表达情况(用平均光密度表示)。

2 结果

2.1 空白组样本、模型组样本大鼠一般体征变化 与空白组样本比较，模型组样本大鼠倦怠少动，粪便干结、水分减少，粪便干结。

2.2 空白组样本、模型组样本大鼠小肠推进率比较 模型组样本大鼠肠道推进率低于空白组样本，差异有统计学意义(P<0.05，见表1)。

表1 空白组样本、模型组样本大鼠小肠推进率比较±s，%)

2.3 各组大鼠一般体征变化 与模型对照组比较，白术七物颗粒高、低剂量组和莫沙必利组大鼠倦怠少动症状改善，粪便水分增多。

2.4 各组大鼠小肠推进率比较 各组大鼠小肠推进率比较，差异有统计学意义(P<0.05)。模型对照组小肠推进率低于空白组，差异有统计学意义(P<0.05)；白术七物颗粒低剂量组、白术七物颗粒高剂量组、莫沙必利组小肠推进率高于模型对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；白术七物颗粒低剂量组、白术七物颗粒高剂量组、莫沙必利组间小肠推进率比较，差异无统计学意义(P>0.05，见表2)。

表2 各组大鼠小肠推进率比较±s,%)

注：与空白组比较，aP<0.05；与模型对照组比较，bP<0.05

2.5 各组大鼠结肠组织c-kit mRNA表达水平比较 各组大鼠结肠组织c-kit mRNA表达水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)。模型对照组、白术七物颗粒低剂量组c-kit mRNA表达水平低于空白组，差异有统计学意义(P<0.05)；白术七物颗粒高剂量组、莫沙必利组c-kit mRNA表达水平高于模型对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。白术七物颗粒低剂量组c-kit mRNA表达水平低于白术七物颗粒高剂量组，差异有统计学意义(P<0.05)。白术七物颗粒高剂量组与莫沙必利组c-kit mRNA表达水平比较，差异无统计学意义(P>0.05，见表3)。

2.6 免疫组化法 将结肠组织切片DAB染色后，选择染色良好区域进行图像采集和分析。对每张切片选取 5 个互不重叠视野在显微镜下(×400)观察，测定平均光密度，即在单位面积的阳性细胞表达，代表其表达情况。c-kit阳性细胞染色后胞质中染色颗粒多呈浅棕色、棕黄色或棕褐色。模型对照组结肠组织中c-kit阳性细胞表达减少，分布稀疏，白术七物颗粒低剂量组、白术七物颗粒高剂量组、莫沙必利组结肠组织中c-kit阳性细胞表达呈不同程度的增加，分布密集(见图1)。各组c-kit表达水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)。模型对照组c-kit表达水平低于空白组，差异有统计学意义(P<0.05)；白术七物颗粒高剂量组、莫沙必利组c-kit表达水平高于模型对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。白术七物颗粒低、高剂量组与莫沙比利组c-kit表达水平比较，差异无统计学意义(P>0.05，见表4)。

Table3Expressionlevelsofc-kitmRNAincolontissuesofratsinthefivegroups

组别只数c-kitmRNA空白组100.84±0.12模型对照组100.72±0.22a白术七物颗粒低剂量组100.73±0.18ac白术七物颗粒高剂量组100.81±0.18b莫沙必利组100.82±0.13bF值3.201P值0.015

注：与空白组比较，aP<0.05；与模型对照组比较，bP<0.05；与白术七物颗粒高剂量组比较，cP<0.05

表4 各组大鼠结肠组织c-kit表达水平

注：为与空白组比较，aP<0.05；为与模型对照组比较，bP<0.05

3 讨论

STC是一类以结肠传输减慢为特点的顽固性便秘，其发病原因及发病机制复杂，治疗方法多种多样，但疗效不显著，且药物治疗时间过长患者对药物会产生依赖性。手术治疗不能解决其肠道的神经性病变和动力障碍，只是切除传输迟缓的病变结肠，未从根本上纠正STC的发病病因，且结肠切除术是有创性的不可逆性的手术治疗方法，选择时应非常慎重。近年来，随着新型药物及非药物治疗方法的应用，STC的治疗得到迅速发展，如现代的生物反馈治疗[6]、心理治疗、针灸治疗[7]、手术治疗[8]及中药复方治疗。

注：A为空白组 ， B为模型对照组，C为白术七物颗粒低剂量组，D为白术七物颗粒高剂量组，E为莫沙必利组

图1 免疫组化分析图(DAB染色，×400)

Figure 1 Expression levels of c-kit in the colon tissue samples stained by immunohistochemistry with DAB

在对中药复方制剂作用机制研究时，要选择疗效明确、有效成分的结构和活性基本清楚的中药复方。白术七物颗粒完全符合这一要求。白术七物颗粒是经多年的临床研究，针对气阴两虚型老年便秘、并以中医理论为指导研制的一种中药复方制剂，并取得了良好的临床疗效[9]。该复方制剂提取槟榔、沉香、木香、乌药、生白术、生地黄、升麻的有效成分，诸药配伍,共奏“益气养阴、行气运下”之功，使腑气得畅，脾滞得运，便秘自除。利用药物化学分析手段组合成白术七物颗粒，以此来探寻中药复方制剂治疗STC的机制研究，成为临床亟需解决的一大课题。研究表明，白术七物颗粒可通过影响STC大鼠结肠组织神经元特异性烯醇化酶(NSE)[10]、P物质(SP)和血管活性肠肽(VIP)[11]治疗STC。另外Cajal间质细胞(ICC)的异常也可以导致STC的发生。

ICC[12]与胃肠运动关系密切，主要位于神经细胞和胃肠道平滑肌细胞之间，可以产生慢波、传导电兴奋、调节神经递质。胃肠道原癌基因c-kit是ICC的特异性标志物，与配体干细胞因子(SCF)结合后，引发细胞间信号的瀑布级链反应，继而调控包含磷酸肌醇-3激酶(PI-3K)等下游底物的多条信号通路，最终活化胞质内的转录因子，从而控制细胞增殖、分化和生长和调节基因表达。而本研究结果表明，白术七物颗粒高剂量组大鼠结肠组织中c-kit阳性表达细胞增加，分布相对较密集，c-kit表达水平升高。

综上所述，白术七物颗粒剂通过增加气阴两虚型STC模型大鼠结肠组织的c-kit表达水平，加快电兴奋传递，增强结肠运动，达到治疗STC的作用。本文不足为未进行白术七物颗粒剂毒理学实验研究，下一步将进行该方面研究；未应用更先进检测方法检测指标，进一步揭示白术七物颗粒剂治疗STC的作用机制。

作者贡献：林仁敬进行实验设计与实施、资料收集整理、撰写论文并对文章负责；鲁海燕、聂晶进行实验实施、评估、资料收集；何永恒进行质量控制及审校。

本文无利益冲突。

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(本文编辑：崔莎)

Effect and Mechanism of Atractylodes Qiwu Granules on C-kit Expression Level in Colon Tissues of STC Rats with Qi-yin Deficiency

LINRen-jing1，LUHai-yan1*，HEYong-heng1，NIEJing2

1.AnorectalDepartment,theSecondAffiliatedHospitalofHunanUniversityofChineseMedicine,Changsha410005,China2.HunanSJALaboratoryAnimalCo.,Ltd，Changsha410100,China

*Correspondingauthor:LUHai-yan,Attendingphysician；E-mail:850157636@qq.com

Objective To investigate the changes of c-kit expression level in colon tissues of STC model rats with qi-yin deficiency under the intervention of Atractylodes qiwu granules,and to explore the possible mechanism of action of Atractylodes qiwu granules in treating the disease.Methods This study was conducted from September to November 2015.A total of 70 SPF grade SD rats were randomized into the blank group(10 males and 10 females) and the model group(25 males and 25 females).Rats in the model group and blank group were subcutaneously injected 2.5 ml/kg of morphine hydrochloride injection,2.5 ml/kg of 0.9% sodium chloride injection,once daily for 45 consecutive days,respectively.The rats in the model group were gavaged with 13 g/kg of the solution with dissolved granules of pericarpium citri reticulatae viride,fructus aurantii and radix aconite carmichaeli on the 16th day of prescribing morphine hydrochloride injection,for 30 consecutive days to establish the STC rat models with qi-yin deficiency.The STC rat models with qi-yin deficiency were verified to be established successfully after the above 45d-intervention by examining the sacrificed 10 of the rats from the model group.The rest 40 rats in the model group were randomized into the model control group,high-dose Atractylodes qiwu granules group,low-dose Atractylodes qiwu granules group,and mosapride group,with 10 evenly composed of males and females in each group.After stopping the previous intervention for 7 days,the model control group,high-dose and low-dose Atractylodes qiwu granules groups,mosapride group and blank group were gavaged with solution of 0.9% sodium chloride injection,high-dose Atractylodes qiwu granules,low-dose Atractylodes qiwu granules,mosapride,0.9% sodium chloride,respectively.RT-PCR and immunohistochemistry were used to detect the expression levels of c-kit in the colon tissue samples taken from the rats of all the groups.Results The intestinal propulsion rate of model group was lower than that of blank group(P<0.05).The model control group had lower intestinal propulsion rate than low-dose and high-dose Atractylodes qiwu granules groups and mosapride group(P<0.05).The expression levels of c-kit mRNA in the model control group were lower than those in low-dose and high-dose Atractylodes qiwu granules groups and mosapride group(P<0.05).The expression levels of c-kit mRNA in low-dose Atractylodes qiwu granules group were lower than those in high-dose Atractylodes qiwu granules group(P<0.05).The model control group had lower expression levels of c-kit than high-dose Atractylodes qiwu granules group and mosapride group(P<0.05).Conclusion Atractylodes qiwu granules acts by increasing the c-kit level in colon tissues to treat STC with qi-yin deficiency.

Constipation;Qi-yin deficiency;Rats;C-kit

国家自然科学基金资助项目(81302977)；湖南省自然科学基金资助项目(13JJ3101)

R 442.2

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2017.21.016

2017-02-11；

2017-05-02)

1.410005湖南省长沙市，湖南中医药大学第二附属医院肛肠科

2.410100湖南省长沙市，湖南省斯莱克景达实验动物有限公司

*通信作者：鲁海燕，主治医师；E-mail:850157636@qq.com