基于Th1细胞功能研究中药合地塞米松对哮喘大鼠pJAKs/pSTATs的影响*

唐秀凤 李晓曦 年宏蕾 杨 燕 许利平 王秀娟 刘仁慧

（首都医科大学中医药学院，北京 100069）

·研究报告·

基于Th1细胞功能研究中药合地塞米松对哮喘大鼠pJAKs/pSTATs的影响*

唐秀凤 李晓曦 年宏蕾 杨 燕 许利平 王秀娟 刘仁慧△

（首都医科大学中医药学院，北京 100069）

目的 观察中药淫羊藿女贞子煎剂及提取物配伍地塞米松对哮喘大鼠肺组织中与Th1细胞信号通路相关的JAKs及STATs蛋白磷酸化表达的影响。方法 SPF级雄性大鼠，随机分为正常对照组（A组）、哮喘模型组（B组）、地塞米松组（C组）、淫羊藿女贞子煎剂组（D组）、地塞米松合煎剂组（E组）、淫羊藿女贞子提取物组（F组）、地塞米松合提取物组（G组）。卵蛋白致敏，激发建立大鼠哮喘模型，腹腔注射地塞米松和/或灌胃淫羊藿女贞子煎剂或提取物，免疫荧光法检测肺组织JAKs（JAK1、JAK2）及STATs（STAT1、STAT2、STAT4）蛋白的磷酸化表达。结果 与A组比较，B组大鼠肺组织pJAK1、pSTAT1、pSTAT2蛋白表达均显著升高（均P＜0.01），pJAK2、pSTAT4蛋白表达显著降低（均P＜0.01）；与B组比较，各给药组pJAK1、pSTAT1、pSTAT2蛋白表达显著降低（P＜0.01或P＜0.05），pJAK2、pSTAT4蛋白表达显著升高（均P＜0.01）；与C组比较，E组、G组能pJAK1、pSTAT1、pSTAT2的蛋白表达显著降低（P＜0.01或P＜0.05），pJAK2、pSTAT2的蛋白表达显著升高（P＜0.01或P＜0.05）。与单用地塞米松比较，地塞米松合煎剂或提取物组能显著性调整pJAK1、pJAK2、PSTAT1、pSTAT2、pSTAT4蛋白的表达。结论 调节哮喘大鼠肺组织中与Th1细胞信号通路相关的JAKs/ STATs可能是淫羊藿女贞子煎剂及提取物协同激素治疗哮喘的作用机制之一。

哮喘 淫羊藿 女贞子 地塞米松 JAKs STATs

近几十年来，支气管哮喘等变态反应性疾病的发病率呈持续性上升趋势。目前，糖皮质激素（GC）仍然是防治哮喘的首选药，但长期大剂量的应用产生的激素耐药及副作用给临床诊治带来诸多问题［1］。JAK（JAKs）/信号传导及转录活化因子（STAT）信号通路与哮喘密切相关，在炎症反应和免疫调节中起重要作用，尤其对T淋巴细胞（Th）分化起主要作用，若异常表达则导致Th1/Th2失衡 （Th1细胞减少或功能低下，Th2细胞增多或功能亢进），从而介导了哮喘的一系列变态反应［2］。本研究选用与Th1细胞减少或功能低下相关的JAK1、JAK2、STAT1、STAT2、STAT4 5个蛋白为研究对象，探索平补阴阳药对淫羊藿、女贞子合用GC治疗哮喘的作用，为中西医结合治疗哮喘提供实验基础。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级健康SD大鼠42只，雄性，体质量（120±10）g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号：SCXK（京）2012-0001。SPF级动物环境，自由饮水、摄食。

1.2 试药与仪器 卵蛋白（美国Sigma公司，A5253-100g），氢氧化铝凝胶（美国Sigma公司，A8222-250 mL），地塞米松磷酸钠注射液（国药集团容生制药有限公司，批号：H41020036，5 mg/支），异硫氰酸荧光（FITC）标记二抗 （北京成文免疫化学研究室，批号：L3202），pJAK1（Santa Cruz Biotechnology，10514），pJAK2（Santa Cruz Biotechnology，J2314），pSTAT1（Cell Signaling，批号：21），pSTAT2（Cell Signaling Technology，批号：1），pSTAT4（Cell Signaling，J0710）。淫羊藿煎剂（西安康威生物有限，批号：20130115）、女贞子煎剂（西安康威生物有限，批号：20130104），淫羊藿、女贞子提取物均由上海一林生物科技有限公司提供，制备方法参考文献［3］。超声雾化器（江苏鱼跃医疗设备有限公司，402A），雾化箱（以有机玻璃为材料自制，规格：40×30×20cm3），NIkon生物显微镜及NIS-Elements BR 3.2图像分析软件（ECLIPSE 80i，北京锐驰恒业仪器科技有限公司），全自动脱水机（德国，LEICA ASP30），包埋机（德国，LEICA EG1150H），切片机（德国，LEICA RM2235）。

1.3 分组与造模 按照随机数字表法将大鼠分为正常对照组（A组）、哮喘模型组（B组）、地塞米松组（C组）、淫羊藿女贞子煎剂组（D组）、地塞米松合煎剂组（E组）、淫羊藿女贞子提取物组（F组）、地塞米松合提取物组（G组），每组6只。于实验第1天、第8天，除正常组外，其余各组均造模［4］。造模成功后，各造模组均每周2次给予1%的卵蛋白雾化吸入，A组雾化生理盐水溶液，直至实验结束。实验第22天开始给药，共计2周，C组、E组、G组腹腔注射地塞米松注射液（0.5 mg/kg）；D组及E组灌胃淫羊藿女贞子煎剂（淫羊藿质量∶女贞子质量=4∶3，0.35 g/kg生药）；F组及G组灌胃淫羊藿女贞子提取物（淫羊藿质量∶女贞子质量=2∶3，100 mg/kg），均每日1次。

1.4 观察指标 实验第36天处死所有动物，开胸，快速取出肺组织。切成厚度约3 mm的组织块，置10%的甲醛溶液内固定24 h。常规石蜡包埋，制片。免疫荧光法检测大鼠肺组织中JAKs（JAK1、JAK2）、STATs（STAT1、STAT2、STAT4）蛋白的磷酸化表达。一抗均用PBS按照1∶50的比例稀释。FITC-荧光二抗用PBS按照1∶100的比例稀释。光镜200倍观察，随机选取3个视野。结果判断：测定其阳性面积（Area）和积分光密度（IOD），取均值代表各细胞因子的表达水平。

1.5 统计学处理 应用SPSS 17.0 for Windows统计软件分析。计量资料以（±s）表示，组间比较采用方差齐性检验及单因素方差分析，根据方差齐性检验结果选择LSD（方差齐）或Tamhane’s T2（方差不齐）。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠pJAK1、pJAK2蛋白表达的比较 见表1。与A组相比，B组大鼠肺组织pJAK1蛋白表达的Area和IOD值均显著上调 （均P＜0.01），pJAK2蛋白表达的Area和IOD均显著下调（均P＜0.01）。与B组比较，各给药组pJAK1蛋白表达的Area和IOD值均显著下调 （均P＜0.01），pJAK2蛋白表达的Area和IOD均显著升高（均P＜0.01）。与C组比较，E组和G组pJAK1蛋白表达的Area和IOD进一步显著降低（均P＜0.01），pJAK2蛋白表达的Area和IOD值显著升高（均P＜0.01）。与单用地塞米松比较，地塞米松合煎剂或提取物组均对pJAK1、pJAK2的蛋白表达有显著影响（均P＜0.01）。2.2 各组大鼠pSTAT1、pSTAT2、pSTAT4蛋白表达的比较 见表2。与A组比较，B组大鼠pSTAT1和pSTAT2蛋白表达显著上升（均P＜0.01），pSTAT4蛋白表达显著降低（均P＜0.01）；与B组比较，5个给药组均能pSTAT1和pSTAT2的蛋白表达显著降低（均P＜0.01），pSTAT4的蛋白表达显著升高 （P＜0.05或P＜0.01）。与C组比较，E组和G组对pSTAT1、pSTAT2、pSTAT4的蛋白表达有显著调整（P＜0.01或P＜0.05）。

表1 各组大鼠表达的pJAK1、pJAK2的蛋白表达比较（±s）

表1 各组大鼠表达的pJAK1、pJAK2的蛋白表达比较（±s）

与A组比较，**P＜0.01；与B组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与C组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。下同。

pJAK1pJAK2组别 n Area（μm2） IOD Area（μm2） IOD A组 6 20.59±0.73 164.49±6.13 10.52±0.13 83.72±1.16 B组 6 C组 6 24.48±1.24**195.70±9.36**14.54±1.20△△115.14±9.31△△7.51±0.14**59.26±1.10**8.43±0.07△△66.83±0.67△△D组 6 17.09±0.69△△▲▲136.18±5.75△△▲▲8.91±0.10△△▲▲70.76±1.22△△▲▲E组 6 17.79±0.42△△▲▲142.40±3.39△△▲▲9.52±0.29△△▲▲75.93±2.23△△▲▲F组 6 18.21±0.51△△▲▲144.99±4.48△△▲▲9.69±0.11△△▲▲77.05±1.05△△▲▲G组 6 20.49±1.14△△▲▲163.57±8.74△△▲▲10.17±0.07△△▲▲80.82±0.63△△▲▲

表2 各组大鼠表达的pSTAT1、pSTAT2、pSTAT4蛋白表达的比较（±s）

表2 各组大鼠表达的pSTAT1、pSTAT2、pSTAT4蛋白表达的比较（±s）

pSTAT1pSTAT2 pSTAT4组别 n n Area（μm2） Area（μm2） IOD Area（μm2） IOD A组 5 8.79±1.35 6 214.17±2.64 280.15±2.90 20.56±0.58 164.90±4.37 B组 5 16.75±1.52**6 279.83±2.64**366.83±3.52**15.22±0.54**124.65±9.26**C组 5 12.44±2.75△△6 221.00±4.05△△289.91±5.55△△16.74±0.48 134.01±4.17△D组 5 11.40±0.68△△6 222.00±4.56△△291.39±6.48△△17.30±1.24△△▲136.97±5.14△△E组 5 12.44±0.64△△6 216.00±1.41△△▲▲282.61±1.74△△17.75±0.48△△141.61±4.47△△▲F组 5 12.76±1.65△△6 218.83±1.72△△286.34±2.33△△18.54±1.01△△▲▲148.50±7.90△△▲▲G组 5 9.44±2.39△△▲6 212.00±1.26△△▲▲279.11±1.51△△19.81±1.22△△▲▲158.95±9.60△△▲▲

3 讨 论

支气管哮喘是一种常见的慢性炎症性气道疾病，多种细胞因子和炎性介质是其病理生理过程形成的始动和维持因素［5］。前期研究发现，IFN-γ和IL-4分别是Th1和Th2细胞的特征性细胞因子，淫羊藿女贞子通过影响IL-4/IFN-γ水平从而纠正哮喘大鼠肺组织中的Th1/Th2功能失衡［5］。随着研究进展，细胞信号传导途径对哮喘的作用越来越受到重视，成为揭示哮喘发病机制的一个新的可能途径。

近年来的研究认为辅助性Th两种亚型Th1、Th2的失衡是哮喘发病的重要机制［6］。这两类转录因子介导细胞因子转录，均通过JAK-STAT信号通路实现。JAKs是一种蛋白酪氨酸激酶［7］，它可在细胞因子受体与相应配基结合后活化，进而激活另一种信号蛋白分子“STAT”而诱导目的基因表达［8］。STAT是一类在胞质中能被众多细胞外多肽类分子激活，参与基因转录调控的蛋白质家族。STAT是JAK/STAT信号通路的核心分子，磷酸化的STAT可穿过核膜进入核内，从而调节相关基因的表达［9］。JAK1、JAK2广泛分布于人和小鼠中，当哮喘发生时，大量与炎症相关的细胞因子被激活，JAK1蛋白表达增加，JAK2蛋白表达减少［10］。研究表明，STAT1、STAT2参与Th1型细胞因子信号转导的抑制。STAT1是STAT家族中第一个被发现的成员，主要参与INFs的应答反应，STAT1存在时IFN-γ可通过调节气道炎症和免疫应答发挥作用。当哮喘发生时，抑制Th1细胞因子分泌，促进STAT1磷酸化蛋白的表达［11］。STAT2仅被IFN-α/β和IFN-λs活化，一般认为STAT1与STAT2形成二聚体而参与哮喘的发病过程。STAT4是Th1分化的必需转录因子，哮喘时被抑制［12］。细胞因子对STAT的激活具有一定选择性，如IL-12、IL-23、IFN-α激活STAT4［13］。信号传导及转录激活因子STAT4在Th1细胞分化以及功能发挥中起重要作用［14-16］，并通过相应JAK途径激活，STAT4接受细胞外IFN-12的信号，从而使STAT4磷酸化。综上所述，本实验中，STAT家族中STAT1、STAT2、STAT4与Th1细胞分化有关，故从与Th1细胞信号通路有关的几个指标研究淫羊藿女贞子药对协同地塞米松的抗炎作用。本实验结果表明，与正常大鼠比较，哮喘模型大鼠JAK1、STAT1、STAT2磷酸化蛋白表达显著上升，这与哮喘发病过程中大量与炎症相关细胞因子的激活相吻合，而JAK2磷酸化蛋白表达下降，推测哮喘过程中Th1类细胞因子IFN-γ的分泌受到抑制，而IFN-γ为活化pJAK2细胞因子之一，IFN-γ的分泌降低导致JAK2的活化表达减少。同样模型组大鼠STAT4的磷酸化表达显著降低。STAT4被认为是调控Th0细胞向Th1方向分化的细胞因子的主要转录因子［17］，STAT4磷酸化表达不足会导致Th1分化信号转导不充分，认为STAT4是生成Th1细胞必须的。给予药物后，5个给药组均能显著调整pJAKs、pSTATs的蛋白表达，抑制 JAK1、STAT1、STAT2的磷酸化蛋白表达，增加JAK2、STAT4的磷酸化蛋白表达，与单用地塞米松比较，地塞米松合煎剂组或合提取物组对JAKs、STATs各蛋白的磷酸化表达的调节作用更优，提示口服中药淫羊藿女贞子合用地塞米松具有协同增效关系。

本课题通过对与Th1信号通路相关的JAKs与STATs蛋白的磷酸化表达进行研究，认为哮喘发病过程中出现的Th1细胞减少或者功能低下等与JAKs激活和活化pSTATs的调控有关。在地塞米松治疗哮喘的同时合用中药淫羊藿女贞子，可通过调节与Th1细胞信号通路相关的JAKs/STATs蛋白的磷酸化表达产生协同增效的治疗作用。

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Effects of Traditional Chinese Medicine Combined with Dexamethasone on pJAKs/pSTATs in AsthmaticRats Based on Th1 Cell Function

TANG Xiufeng，LI Xiaoxi，NIAN Honglei，et al. School of Traditional Chinese Medicine，Capital Medical University，Beijing 100069，China.

Objective：To study the effects of the decoction and extracts of Epimedium and Fructus Ligustri lucidi（EF）on JAKs/STATs protein phosphorylation which was connected with Th1 cell signaling pathways in lung tissues of asthmatic rats atomized by dexamethasone.Methods：The SPF rats were randomly divided into seven groups，including normal control group （A group），asthma model group（B group），dexamethasone group（C group），EF decoction group （D group），EF decoction plus dexamethasone group（E group），EF extracts group（F group），and EF extracts plus dexamethasone group（G group）.Asthmatic rat model was duplicated by injection and atomization inhalation of OVA.And treatment was applied by intraperitoneal injection of dexamethasone and/ or gavage with EF decoction or EF extracts.The phosphorylation protein expressions of JAKs（including JAK1，JAK2）and STATs（including STAT1，STAT2，and STAT4）of lung tissues were detected in rats of all groups by the method of immunofluorescence.Results：Compared with A group，the protein expression of pJAK1，pSTAT1 and pSTAT2 in lung tissue were significantly increased（all P＜0.01）in B group，and the protein expression of pJAK2 and pSTAT4 were also significantly decreased（all P＜0.01）.Compared with B group，the protein expression of pJAK1，pSTAT1 and pSTAT2 in five treatment groups were significantly decreased（P＜0.05 or P＜0.01），and the protein expression of pJAK2 and pSTAT4 increased significantly（all P＜0.01）.Compared with C group，E group，G group could significantly reduce the protein expression of pJAK1，pSTAT1，pSTAT2（P＜0.05 or P＜0.01），and significantly increase pJAK2 and pSTAT2 protein expression（P＜0.05 or P＜0.01）.Compared with dexamethasone group，the EF decoction plus dexamethasone group or EF extracts plus dexamethasone group had abetter effect on the protein expression of pJAK1，pJAK2，pSTAT1，pSTAT2，pSTAT4 protein.Conclusion：Combination of dexamethasone with EF may produce a synergistic interaction effect on asthma by adjusting JAKs/STATs protein phosphorylation expression which is connected with Th1 cell signaling pathways.

Asthma；Herba Epimedium；Fructus Ligustri lucidi；Dexamethasone；JAKs；STATs

R285.5

A

1004-745X（2017）05-0753-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.05.001

2017-01-22）

国家自然科学基金资助项目（81373814）；北京中医药薪火传承“3+3”工程二室一站建设

项目（2012-SZ-C-42）；北京市属高等学校高层次人才引进与培养计划项目（CIT＆TCD201504097）

△通信作者（电子邮箱：liurenhui995@163.com）