广西肝癌高发区原发性肝细胞癌HBV X基因的整合及影响因素分析

吴杭航黄天壬邓伟方向任静静甘膺元

作者单位：530021南宁1广西医科大学附属肿瘤医院实验研究部；2广西医科大学研究生院

广西肝癌高发区原发性肝细胞癌HBV X基因的整合及影响因素分析

吴杭航1，2黄天壬2邓伟1方向1，2任静静1，2甘膺元1，2

作者单位：530021南宁1广西医科大学附属肿瘤医院实验研究部；2广西医科大学研究生院

目的了解广西肝癌高发区乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）X区基因在肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）染色体中的整合及影响因素。方法以30例与HBV相关的原发性肝细胞癌患者为研究对象。提取HCC组织及癌旁组织标本DNA作为模板，以HBV X基因上游序列和人类基因组Alu重复序列为引物，应用重复序列-多聚酶链反应（Alu-PCR）扩增整合的HBV X片段及两侧的人类基因组DNA片段。扩增产物进行测序，计算目的片段整合率并分析相关的影响因素。结果18例HCC组织检测到HBV X基因的整合片段，整合率为60.00%（18/30）；26例癌旁组织检测到HBV X基因的整合片段，整合率为86.67%（26/30）。癌旁组织HBV病毒整合率高于HCC组织，差异有统计学意义（χ2=5.445，P=0.020）。不同性别、年龄、HBeAg、HBV DNA、ALT、AST的HCC癌组织及其癌旁组织H BV X基因整合率比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。结论广西肝癌高发区癌旁组织比HCC组织HBV整合率高，说明HBV整合发生在感染早期。HBV X基因整合与HCC患者性别、年龄、HBeAg、HBV DNA、ALT、AST无明显关系。

肝肿瘤；乙型肝炎病毒X基因；整合；广西

肝癌是我国常见的恶性肿瘤，死亡率居全部恶性肿瘤的第2位，占全世界肝癌死亡人数的51%［1-2］。广西作为我国肝癌的高发区，肝癌病死率居恶性肿瘤首位，高于全国平均水平［3］。乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是肝癌发生的主要原因，患者HBsAg总阳性率为84.76%［4］。1980年Brechot等［5］首次发现在HBV感染的肝癌细胞中有HBV DNA整合到宿主基因。1995年Minami等［6］建立Alu-PCR用于检测HBV病毒-细胞接头序列。自此国内外开始陆续报道肝癌组织中HBV整合的状况及其致癌机制，但广西肝癌高发区肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）中HBV X基因的整合，目前未有相应研究。本研究采用Alu-PCR方法扩增整合HBV X片段及两侧人类基因组DNA片段，了解目的片段整合率并分析相关影响因素，为广西HCC高发区HBV相关性HCC的病因研究提供依据。

1 材料和方法

1.1 研究对象

30例患者均来自广西肝癌高发区扶绥县，在广西医科大学附属肿瘤医院行肝癌切除术，经病理学检查确诊为原发性肝细胞癌。平均年龄45.4岁（33～70岁），其中男性25例，女性5例。收集研究对象的临床资料及手术切除的HCC组织及癌旁组织（距离癌组织大于5 cm以外的肝组织）标本，经液氮速冻后储存于－80℃冰箱备用。

1.2 主要试剂和仪器

组织DNA提取试剂盒、PCR试剂盒购自德国QIAGEN公司，UDG酶购自美国Thermo公司，PCR产物纯化和全自动测序由北京六合华大基因科技公司完成。PCR仪购自德国Biometra公司，电泳仪购自美国Thermo公司。

1.3 组织DNA提取

采用德国QIAGEN公司DNA提取试剂盒，方法参照说明书进行操作。

1.4 Alu-PCR引物

［7］设计引物，第一轮PCR扩增引物为HBV上游序列pUTP和正/反向的人类基因组重复序列Alu UP5/T3-515。在合成pUTP和UP5/T3-515时，用dUTP代替dTTP。第二轮PCR扩增引物位于pUTP下游的HBV序列MM37和ALU正/反向序列UP6/ MidT3。第三轮“半巢式”PCR扩增引物为HBV序列MM60和UP6/MidT3。见表1。

表1 Alu-HBV-PCR引物序列

1.5 Alu-PCR扩增HBV X基因整合片段

第一轮PCR反应以组织DNA为模板，总量不超过1 000 ng，反应体系总体积为100μL，其中引物pUTP、UP5/T3-515各2 uL，Taq DNA聚合酶50μL，加去离子水至100μl。反应条件：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35个循环；72℃延伸10 min。PCR反应结束后，产物16℃水浴1min，每PCR反应液加入UDG酶5U，37℃消化60 min，使含有dUTP的DNA位点断裂，95℃10min终止反应。第二轮PCR反应体系总体积100μL，取第一轮反应产物3μL为模板，引物MM37、UP6/MidT3各2μL，Taq DNA聚合酶50μL，去离子水43μL。反应条件：94℃预变性3min；94℃变性30 s，48℃退火30 s，72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸10min。第三轮PCR反应体系与第二轮相同，取第二轮反应产物10μL，稀释500倍作为第三轮PCR模板，引物MM60、UP6/MidT3各2μL，Taq DNA聚合酶50μL，模板46μL。反应条件：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，60℃（正向）/56℃（反向）退火30 s，72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸10min。

1.6 测序及目的片段整合分析

取第三轮PCR产物10μL经1.5%琼脂糖凝聚电泳观察扩增结果，出现阳性条带的标本送北京六合华大公司（广州）进行纯化，并经ABI3730x1基因分析仪进行双向测序。结果经NCBIBLAST（https：//blast.ncbi. nlm.nih.gov/Blast.cgi）分析HBV X基因整合的基本情况。

1.7 统计学分析

采用SPSS 16.0软件进行数据统计分析。计数资料采用百分率表示，样本率的比较采用χ2检验或确切概率法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HBV X基因整合片段的扩增及测序结果

在30例HCC癌组织及其配对的癌旁组织中，扩增出阳性条带25例，其中正向PCR结果9例，反向PCR结果4例，同时为正向和反向PCR结果12例，部分电泳结果见图1；阳性条带纯化后测序成功18例，其中正向PCR结果3例，反向PCR结果12例，同时为正向和反向PCR结果3例，共21根条带，测序峰如图2所示。在癌旁组织中扩增出阳性条带29例，其中正向PCR结果1例，反向PCR结果3例，同时为正向和反向PCR结果24例，部分电泳结果见图1；阳性条带纯化后测序成功26例，其中正向PCR结果和反向PCR结果各7例，同时为正向和反向PCR结果12例，共38根条带。8P和11P反向反应各有两个测序结果，测序峰如图3所示。

2.2 HBV X基因整合率

在30例研究对象中，总整合率为73.33%（44/60），肝癌组织中18例检测到HBV X基因整合片段，整合率为60.00%（18/30）；癌旁组织中26例检测到HBV X基因整合片段，整合率为86.67%（26/30）。癌旁组织HBV病毒整合率高于HCC组织（χ2=5.445，P=0.020）。

2.3 HBV X基因整合与HBV感染指标的关系

进一步分析影响HBV X基因整合的因素，结果显示，不同性别、年龄、HBeAg、HBV DNA、ALT、AST的HCC癌组织及其癌旁组织HBV X基因整合率差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

图1 HBV X基因扩增部分电泳结果

图2 样本6T测序结果峰图

图3 样本6P测序结果峰图

表2 HBV X基因整合的影响因素分析［n（%）］

（续表）

3 讨论

HBV整合到宿主基因是HBV感染过程常见的现象，有研究显示，85%～90%的HBV相关HCC组织可检测到HBV DNA整合［8］。随后大量研究发现，HBV携带者、HBV肝炎患者、肝硬化及HCC患者均可检测到HBV DNA整合［9］，可见HBV整合是HCC发生发展过程中的一个重要环节。

本研究为提高整合率，同时应用正向和反向HBV-Alu-PCR方法，对广西肝癌高发区HBsAg阳性的HCC组织及其配对癌旁组织中整合的HBV序列进行分析，探讨整合HBVDNA与HBV致癌的相关性。结果发现，癌旁组织HBV整合率（86.67%）高于HCC组织（60.00%）。而贺良等［10］采用Alu-PCR技术检测HCC标本，发现40例HCC中HBV X基因整合率为45.00%。张婷等［11］采用Alu-PCR和LM-PCR方法检测肝癌组织和癌旁组织，发现肝癌组织HBV X基因整合率（65.0%）稍低于癌旁组织（67.5%），本研究与张婷等［11］研究结果一致，且癌旁组织的整合率远高于癌组织，说明HBV DNA的整合是慢性乙型肝炎发展成肝癌过程中的一个早期事件。此外，本研究的总体整合率高于国内其他研究［12-14］，说明广西肝癌高发区HBV X基因整合与HCC的发生有密切关系，可能是本地区HCC发生率高于全国水平的原因之一。本研究中12例HCC组织和4例癌旁组织未检测出HBV X基因整合序列，可能本身未整合或者HBx的整合序列出现在引物HBx下游或引物Alu上游，也可能整合基因在HBV的S区或C区［10］。

进一步分析HBV X基因整合条带与HCC的关系，结果发现，阳性条带测序的长度在335～1008 bp之间，其中2例癌旁组织检测到2个条带，说明HBV基因截短插入宿主基因，片段长度不一，整合可发生在不同的位置［15］，与屠红等［16］的研究结果一致。进一步证实截短的HBV X基因产物可影响HCC的发生发展，而不需要HBV全长整合入宿主基因发挥致癌作用。

关于HBV X基因整合与HBV感染指标及肝功能的关系，本研究结果显示HBV X基因的整合率在不同性别、年龄、HBeAg、HBVDNA、ALT、AST的HCC患者中的分布差异无统计学意义（P＞0.05）。贺良等［10］发现HBV整合与HCC患者性别、年龄、AFP、癌栓及复发等无关，与HBV DNA、肿瘤大小、分化程度呈正相关。Sung等［17］发现，HBV整合的HCC患者年龄低于未整合者，并认为HBV DNA与致癌基因整合，是HCC患者未经肝硬化过程而直接发生癌变的原因之一。本研究并未得到类似结论，可能与研究例数较少有关，也可能说明广西肝癌高发区的HBV X基因整合与性别、年龄及HBV感染指标的关系并不密切。当地人群中的HBV基因型及亚型、不同患者体内HBV准种的特征及优势株以及HBV的某些突变点可能是影响其整合率的关键因素，需在今后的研究中加以验证。

越来越多的证据显示HBV DNA的整合与HCC有关，阐明与肝癌发生发展有关的整合位点，对未来指导基因诊断和治疗具有重要意义［18］。本研究对广西肝癌高发区的HCC组织和癌旁组织HBV X基因整合率及临床资料进行分析，证实了HBV DNA的整合是HCC发生过程中的一个早期事件，为本地区研究整合HBV DNA与HBV致癌机制提供了依据。

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［2017-03-31收稿］［2017-04-15修回］［编辑江德吉］

Analysis of hepatitis B virus X gene integration and potential risk factors of integration in patientsw ith hepatocellular carcinoma in the high-incidence area of Guangxi

Wu Hanghang1，2，Huang Tianren2，Deng Wei1，Fang Xiang1，2，Ren Jingjing1，2，Gan Yingyuan1，2（1Department of Research，Affiliated Tumor Hospital of GuangxiMedical University，2Graduate School of GuangxiMedical University，Nanning 530021，P.R.China）

Huang Tianren.E-mail：tianrenhuang@sina.com Deng Wei.E-mail：9608946@qq.com

Objective To analyze integration ofhepatitis B virus（HBV）X gene into the genome of primary hepatocellular carcinoma（HCC）tumors and surrounding tissue，and to explore potential risk factors of such integration in patients from the HCC high-incidence area of Guangxi.Methods DNA was extracted from HCC tissue and adjacent non-tumor liver tissue of 30 patientswith HBV-related HCC.Primers were designed to amplify the HBV X sequence and human Alu repeats by Alu-PCR，and PCR products were Sangersequenced.Results Among the 30 patients，18（60.00%）showed integration of the HBV X gene into HCC tumors，compared to 26（86.67%）who showed X gene integration into adjacent liver tissue（χ2=5.445，P=0.020）.Incidence of X gene integration did not vary significantly with sex，age，HbeAg status，HBV DNA load，ALT or AST in HCC tissue or adjacent non-tumorous liver tissue（P>0.05）. Conclusions Incidence of HBV integration is higher in non-tumorous tissues than in tumorous tissues in patients with HBV-related HCC in Guangxi.HBV integration appears to occur in early stages of HCC development.HBV X gene integration does not appear to be influenced by sex，age，HBeAg status，HBV DNA load，ALT or AST.

Hepatocellular carcinoma；Hepatitis B virus X gene；Integration；Guangxi

R735.7

A

1674-5671（2017）03-05

10.3969/j.issn.1674-5671.2017.03.02

国家自然科学基金资助项目（81660561，81260319）；广西高校科学技术研究资助项目（KY2015ZD025，ZD2014039）

黄天壬。E-mail：tianrenhuang@sina.com邓伟。E-mail：9608946@qq.com