TM T定量蛋白质组学方法筛选鼻咽癌复发相关表达蛋白

蒙慧玲朱小东李龄梁忠国潘信斌曾凡艳曲颂

作者单位：530021南宁1广西医科大学附属肿瘤医院放疗科；2广西医科大学研究生院；3区域性高发肿瘤早期防治研究教育部重点实验室

基础研究

TM T定量蛋白质组学方法筛选鼻咽癌复发相关表达蛋白

蒙慧玲1，2朱小东1，3李龄1梁忠国1潘信斌1曾凡艳1曲颂1，3

作者单位：530021南宁1广西医科大学附属肿瘤医院放疗科；2广西医科大学研究生院；3区域性高发肿瘤早期防治研究教育部重点实验室

目的筛选鼻咽癌复发与正常复查随访患者血清差异表达蛋白，寻找鼻咽癌复发诊断的标志物。方法采集复发20例和正常复查随访20例鼻咽癌患者血清，采用TMT联合二维质谱筛选差异蛋白。进一步收集新标本并采用酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbentassay，ELISA）验证差异蛋白，其中复发40例和正常复查随访41例。结果血清中共鉴定出635个蛋白，其中可定量蛋白为413个。两次生物学重复实验中，复发组均表现下调的蛋白有41个，均表现为上调的蛋白有18个。血清ELISA验证结果发现，复发组A2M蛋白浓度较正常复查随访组低（Z=-3.177，P=0.001）。复发组40例患者中可测出A2M蛋白浓度23例，正常复查随访组41例患者中可测出A2M蛋白浓度30例，Spearman相关分析结果显示，可测复发组和可测正常复查随访组患者A2M蛋白浓度与肿瘤分期（r=-0.024，P=0.866）、年龄（r=-0.087，P=0.534）均无相关性，两组患者年龄、性别及肿瘤分期等差异无统计学意义（P＞0.05）。结论A2M蛋白可能是鼻咽癌复发诊断的潜在标志物。

鼻咽肿瘤；鼻咽癌复发；TMT；蛋白质组学；A2M；生物标志物

放疗是鼻咽癌的主要治疗手段。然而，原发性鼻咽癌即使经过规范治疗，部分患者仍难以避免地出现鼻咽局部和（或）颈淋巴结引流区域肿瘤复发，一旦出现复发，其治疗效果不理想［1］。目前临床上仍缺乏有效监测鼻咽癌复发的生物标志物。TMT是定量蛋白质组学中较为常用的方法［2-3］。本研究拟采用TMT法联合质谱寻找鼻咽癌复发相关的生物学标志物，为鼻咽癌复发诊疗提供新的可能途径。

1 材料与方法

1.1 临床资料

采集2008年至2015年广西医科大学附属肿瘤医院放疗科诊治患者的血清标本，所有患者均在未予任何治疗情况下采血，均为初诊经病理学诊断为未分化型非角化性鼻咽癌；接受处方剂量均≥70 Gy；复发患者均为治疗6个月以后，经病理学诊断为鼻咽癌复发。正常复查随访患者均为治疗6个月后，复查未见明显鼻咽癌复发征象。排除严重心肺功能损伤患者。

选取其中复发患者20例（复发组），正常复查随访患者20例（正常复查随访组），然后分别对两组患者进行编号，再由电脑系统随机选取10例为复发1组，另外10例复发患者为复发2组；10例正常复查随访患者为正常复查随访1组，另外10例为正常复查随访2组。以复发1组对比正常复查随访1组，复发2组对比正常复查随访2组，进行两次生物学重复试验，通过TMT联合二维质谱对比筛选差异蛋白。复发组与正常随访组患者平均年龄分别为47.15岁和41.50岁，差异有统计学意义（P＜0.05），两组性别、肿瘤分期差别无统计学意义（P＞0.05）。

为验证差异蛋白在血清中的含量是否与上述质谱结果一致，进一步收集新标本进行酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbentassay，ELISA）验证。再次由电脑随机系统随机产生编号，其中复发组40例，正常复查随访组41例。复发组与正常复查随访组患者年龄、性别、肿瘤分期差异无统计学意义（P＞0.05）。本研究征得广西医科大学伦理委员会批准，所有受试者均知情并签署知情同意书。

1.2 材料与设备

TMT试剂盒购自Thermo公司，胰酶购自Promega公司，三氟乙酸、乙腈、超纯水购自Fisher Chemical公司，甲酸购自Fluka公司，碘代乙酰胺、二流苏糖醇、尿素、四乙基溴化铵购自Sigma公司，蛋白酶抑制剂购自Calbiochem公司，BCA试剂盒购自碧云天公司，高丰度蛋白去除试剂盒购自Bio-Rad公司，ELISA试剂盒购自TSZ公司。

1.3 实验步骤

1.3.1 TMT标记及高效液相色谱法（High-performance liquid chromatography，HPLC）分级将复发组和正常复查随访组各10例血清等量混合，离心后取上清液，去除高丰度蛋白，用BCA试剂盒进行蛋白浓度测定，洗脱液分别取20μg进行SDS-PAGE电泳检测高丰度蛋白去除情况。胰酶酶解肽段用Strata X C18（Phenomenex）除盐后真空冷冻干燥。以0.5 M TEAB溶解肽段，根据TMT试剂盒操作说明标记肽段［复发1组（Y1）：130；复发2组（Y2）：131；正常复查随访1组（N1）128；正常复查随访2组（N2）129）］。肽段采用高pH反向HPLC分级，色谱柱为Thermo Betasil C18 Column。

1.3.2 质谱分析肽段采用EASY-nLC 1000超高效液相系统分离，并同步使用Thermo ScientificTM Q ExactiveTM Plus进行检测和分析。肽段分离后进行电离，然后进入Q ExactiveTM Plus质谱进行分析。肽段母离子及其二级碎片均采用Orbitrap检测和分析。二级质谱数据采用Mascot search engine（v.2.3.0）检索，同时进行质谱质控。

1.3.3 ELISA验证质谱结果由于质谱结果存在假阳性可能，需进行后期验证。鉴于A2MA蛋白差异倍数较大，且相关报道其在肿瘤致瘤性、抑制肿瘤增殖、转移等均有作用［4-6］，因此本研究选择A2M蛋白进行验证。实验严格按A2M蛋白的ELISA试剂盒说明书进行操作。具体步骤：⑴加入50μL标准品或样品，室温孵育45 min；⑵弃上清液，加入洗涤液清洗4次；⑶加入生物素化抗体50μL，室温下孵育30 min；⑷清洗，重复步骤⑵；⑸加入酶联亲和素50μL，室温下孵育15 min；⑹清洗，重复步骤⑵；⑺加入色素原A和色素原B 50μL，室温下孵育15 min；⑻加入停止反应液50μL终止反应；⑼酶标仪测吸光度（ELISA可测范围为0.5～90 ng/mL）。

1.4 统计学处理

采用SPSS 18.0统计软件对数据进行统计分析。两组蛋白的表达分布、蛋白表达和肿瘤分期的相关性检测采用秩和检验；蛋白表达与年龄、肿瘤分期的相关性采用Spearman相关分析法，基线特征比较采用χ2检验或Fisher确切概率法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 质谱筛选差异蛋白的结果

对质谱结果进行质控，结果发现两次生物学重复实验结果一致性良好，见图1。两组患者血清中共鉴定出蛋白635个，其中可定量蛋白413个。设≥1.2倍，≤0.83倍为差异倍数，两次生物学重复实验中，复发组均表现下调的蛋白41个，均表现为上调的蛋白18个。见表1。

图1 两次生物学重复实验的重复性分析热力图

表1 两次生物学重复实验的共同差异蛋白

2.2 ELISA验证A2M蛋白在血清中的表达

A2M蛋白的二级质谱图如图2所示。血清A2M浓度数据不符合正态分布，方差不齐，经两独立样本秩和检验，选取中位数及四分位法对蛋白浓度进行描述，复发组和正常复查随访组A2M蛋白浓度中位数分别为34.79 ng/mL和75.67 ng/mL，第25%位数的浓度分别为13.27 ng/mL和40.03 ng/mL；第75%位数的浓度分别为61.86 ng/mL和151.92 ng/mL，正常复查随访组表达量高于复发组，两组A2M蛋白表达差异有统计学意义（Z=-3.177，P=0.001）。

进一步构建ROC曲线验证A2M蛋白检测鼻咽癌复发的效能，结果ROC曲线下面积为0.757，A2M最佳界值点为35.21 ng/mL，灵敏度为56.5%，特异度为86.7%。见图3。

图2 A2M蛋白的二级质谱图

图3 A2M蛋白的ROC曲线

2.3 A2M蛋白浓度与患者肿瘤分期、年龄的相关性

ELISA验证实验中，复发组40例患者可测出A2M蛋白浓度23例（可测复发组），17例因A2M蛋白浓度过低不可测。正常复查随访组41例患者，可测出A2M蛋白浓度30例（可测正常复查随访组），不可测11例。Spearman相关分析结果显示，可测复发组和可测正常复查随访组患者A2M蛋白浓度与肿瘤分期（r=-0.024，P=0.866）、年龄（r=-0.087，P=0.534）均无相关性。进一步对比分析可测组组内（复发组可测23例和正常复查随访组可测30例）、不可测组（复发组不可测17例及正常复查随访组不可测11例）组内、复发组组内（可测23例和不可测17例）和正常复查随访组内（可测30例和不可测11例）患者的临床资料，结果显示各组年龄、性别及肿瘤分期差异均无统计学意义（P＞0.05）。

3 讨论

鼻咽癌即使经过规范化治疗，仍有约20%的患者复发［1］，而复发患者的预后往往较差。目前临床上仍缺乏有效检测鼻咽癌预后的生物学指标，检测复发的主要手段为影像学检查，然而发现复发时，往往肿瘤已发展至较晚程度，再次治疗难以达到理想的效果［7］。研究发现肿瘤在发展阶段会分泌一些因子，某些因子表达亦可能上调或下调，这成为寻找肿瘤标志物的重要特征［8］。

TMT［2-3，9］是一种基于肽段层面的体外标记技术，其原理是标志物特异性标记多肽的氨基端，随后进行质谱分析。TMT试剂由报告基团、平衡基团和反应基团三部分组成。其中，反应基团与氨基酸N端及侧链的伯胺基团发生反应，在一级质谱中，不同来源的相同肽段被标记后出现相同的质荷比。在二级质谱中，平衡基团断离，被不同标签标记的相同肽段出现不同的报告离子，根据不同报告离子的相对丰度可获得样本间相同肽段的相对定量信息，经相应软件处理后，可明确蛋白质的定量信息。本研究采用此方法筛选出鼻咽癌复发相关差异蛋白635个，同时进行了两次独立的生物学重复实验，两次实验共同的差异蛋白为59个，其中筛选差异显著的A2M蛋白作为研究蛋白之一。TMT标记法常见的干扰因素为干扰离子与母离子碎片混合干扰标记，从而导致标签标记的正确率降低［3］，因此有出现假阳性的可能，因此，针对质谱的结果，本研究进一步收集新标本进行后期验证，经ELISA验证，结果发现差异蛋白在血清中的含量与质谱结果一致。

A2M是一种广谱的蛋白酶抑制剂，可减少自由基的产生，亦参与炎症反应过程［6，10-11］。有报道A2M与卵巢癌［12］、转移性骨肉瘤［13］、肺癌［14］、星型细胞瘤［15］等发生发展相关。但尚未见A2M与鼻咽癌的相关报道。在星型胶质瘤中，A2M与其受体LRP1相结合，可抑制其转移、浸润。相对非结合的A2M，A2M与LRP1形成的复合物更能激活蛋白酶抑制剂，可执行更强大的肿瘤抑制功能，且该复合物可通过减弱Wnt/βcatenin信号通路调节肿瘤抑制功能［15］，A2M还可与Grp78、MMP-2、IGFBP-1和IGFBP-2等配体结合，产生不同功能［16-19］。本研究结果发现，A2M蛋白在复发组患者血清中表达下调，提示A2M可能在鼻咽癌致病过程中起抑制作用。进一步查阅文献发现，皇甫超济等［6］对多位学者关于A2M对肿瘤的影响观点进行了汇总分析，其中有研究将相当生理量的A2M放入白血病细胞培养基中，发现细胞分裂、增殖受抑制，且在体内实验也得到了同样的结果，表明A2M有抑制肿瘤增殖作用，并认为这一功能与其抗蛋白酶及抗自由基作用相关。肿瘤的浸润和转移能力与细胞的蛋白水解酶活性相关，A2M蛋白水解酶活性高，可提高肿瘤转移浸润能力。另一观点为所有恶性肿瘤均有机会脱落进入血液循环，穿透血管壁的能力主要取决于血管的通透性。而在正常情况下，血管内皮细胞表面有一层A2M，A2M的数量是决定这一通透性的主要原因，因此，所有能消耗A2M的物质均能促进肿瘤转移，相关实验已证明A2M抗血清能促进肿瘤细胞转移。结合上述观点，推断A2M在鼻咽癌复发的致病过程中可能起抑制肿瘤增殖、复发的作用，然而A2M是否结合其相应配体产生抗肿瘤机制，还是独立进行蛋白酶抑制剂作用，目前尚不明确。此外，A2M与Wnt/ β-catenin［15］、PI3K/Akt［20］信号通路的相关性均有报道，A2M与这两通路是否是鼻咽癌复发的相关因素，将是我们下一步研究的方向。

此外，本研究在筛选阶段中因两组患者年龄差异有统计学意义，因此在后期差异蛋白的验证阶段进行了差异蛋白与年龄间的相关性分析，结果显示A2M差异蛋白浓度与年龄无相关性。同时发现不论是复发组还是正常复查随访组，均存在部分标本A2M蛋白浓度过低，无法测出。因此，我们对可测组和不可测组患者进行了常规的基线资料分析，发现两组间差异无统计学意义。说明影响蛋白表达的因素不止年龄、性别及肿瘤分期等，患者饮食、生活习惯、环境等均有可能是影响蛋白表达的因素，需进一步分析及验证。

本研究采用TMT联合二维质谱筛选出鼻咽癌复发相关蛋白A2M，ELISA验证结果与质谱分析结果一致。同时构建ROC曲线，发现A2M蛋白具有较高的灵敏度，提示其有望成为鼻咽癌复发诊断的潜在标志物之一。但因本研究样本量较小，此外，A2M蛋白浓度变异大，未进行同一患者复发前后对比研究，且标本收集和ELISA验证阶段的人员、环境、温度等均有可能造成血清蛋白不同程度降解而影响实验结果，因此有关结论需进一步验证。

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［2017-02-10收稿］［2017-03-25修回］［编辑罗惠予］

Identification of novel serum biomarkers for recurrent nasopharyngeal carcinoma using TMT-based quantitative proteom ic analysis

Meng Huiling1，2，Zhu Xiaodong1，3，Li Ling1，Liang Zhongguo1，Pan Xinbin1，Zeng Fanyan1，Qu Song1，（31Department of Radiation Oncology，Affiliated Tumor HospitalofGuangxiMedical University；2Graduate SchoolofGuangxiMedical University；3Key Laboratory of Education Ministry for Early Prevention and Treatment of Cancer in Guangxi Zhuang Autonomous Region，Nanning 530021，P.R.China）

Qu Song.E-mail：daisyqs2002@163.com

Objective To identify proteins differentially expressed between recurrent nasopharyngeal carcinoma（NPC）and nonrecurrentNPC.M ethod Serumwascollected from 20 patientswith recurrentNPCand 20 patientswith non-recurrentNPC.Weused tandem mass tag labeling and high performance liquid chromatography fractionation，followed by liquid chromatography-tandem mass spectrometry to identify differentially expressed proteins.Candidateproteinswere confirmed by ELISA in a separate setofserum samples comprising 40 patientswith recurrentNPC and 41with non-recurrentNPC.Results A totalof635 protein groupswere identified in human serum，and expression levels of 413 proteinswere quantified.In two independent tests with different subgroups of patients，41 proteins were found to be down-regulated and 18 to be up-regulated in recurrent disease.ELISA confirmed that A2M was down-regulated in 23 patients with recurrent disease compared to 30 with non-recurrent disease.（Other patients had A2M levels below the detection threshold of the ELISA）.Spearman analysis showed that A2M concentration did not correlatewith clinical stage（r=-0.024，P=0.866）or age（r=-0.087，P=0.534）.Conclusion A2M expressionmay protect against risk of NPC recurrence and somay be a useful prognosticmarker.

Nasopharyngeal neoplasms；Recurrent nasopharyngeal carcinoma；TMT；Proteomics；A2M；Biomarker

R739.63

A

1674-5671（2017）03-05

10.3969/j.issn.1674-5671.2017.03.01

广西医疗卫生重点科研课题资助项目（重2012091）；区域性高发肿瘤早期防治研究教育部重点实验室资助项目（GK2014-ZZ12，GK2015-ZZ05）

曲颂。E-mail:daisyqs2002@163.com