海南地不容中总生物碱的提取及含量测定

程莎+莫国平+戴华+白丽丽

摘 要 采用正交試验法优选海南地不容的提取工艺并进行含量测定。以提取的总生物碱为考察指标，醇的体积分数、提取功率、提取时间、次数、料液比分别为考察因素，设计正交试验确定超声提取总生物碱的最优工艺。以盐酸小檗碱为对照品，利用分光光度法在418 nm处测定海南地不容中总生物碱的含量。最佳工艺为醇体积分数80%、超声提取30 min、功率160 W、料液体积比1∶20、提取2次。小檗碱在0.0～18.0 μg/mL范围内线性关系良好（r=0.999 4）。平均回收率为99.03%，RSD=2.38%（n=6）。总生物碱含量可达到4.67%。确定的提取工艺简单，用时少，提取率高。建立的测量方法简单、灵敏度高、重现性好，适用于海南地不容中总生物碱的含量测定。

关键词 海南地不容 ；总生物碱 ；提取 ；含量 ；正交试验

中图分类号 S567.236 ；R284 文献标识码 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2017.06.017

Extraction and Determination of Total Alkaloids from

Stephania hainanensis

CHENG Sha1） MO Guoping1） DAI Hua2） BAI Lili1）

（1 School of Pharmaceutical Sciences， Hainan Medical University， Haikou， Hainan 571199；

2 School of Public Health， Hainan Medical University， Haikou， Hainan 571199）

Abstract An orthogonal experiment was designed to screen an optimum method for extraction of total alkaloids from Stephania hainanensis. The total alkaloids extracted was used as an index， and ethanol volume fraction， extraction time， altrasonic power， extraction frequency were used as factors to design the orthogonal experiment to optimize the altrasonic extraction of the total alkaloids from S. hainanensis. The content of total alkaloids extracted was determined by using spectrophotometry at 418 nm with berberine hydrochloride as a reference substance. The extraction was identified optimum when the volume fraction of ethanol was 80%， the extraction time was 30 min， the altrasonic power was 160 W， the solid-liquid ratio was 1：20， and the extraction frequency was 2 times. Berberine hydrochloride had a good linear relationship （r=0.999 4） at the range of 0～18.0 μg/mL. The average recovery was 99.03% （RSD=2.38%）. The content of total alkaloids extracted was 4.67%. This extraction technology was proved to be simple， time saving and higher in extraction rate. The determination method for total alkaloids was easy， highly sensitive and good in repeatability， and can be used for determination of the content of total alkaloids from S. hainanensis.

Keywords Stephania hainanensis ； total alkaloids ； extraction ； determination ； Orthogonal experiment

地不容（Stephania Hainanensis Lo et Y Tsoong）又名金不换、山乌龟、金钱吊，是防己科千金藤属草质藤本，属海南特有植物。生于海南岛大山石缝、峭壁、乱石堆的半阴处或溪边丛林中[1]。地不容作为海南黎族的传统医药，味苦而辛，性凉，有小毒，具有清热解毒、镇静、理气、止痛等功效[2]。国内外对该属植物化学成分和药理活性的研究较多[3-6]，但有关海南地不容总生物碱的提取以及含量测定却鲜有报道。据文献报道，海南地不容中主要含有吗啡型生物碱、阿扑啡型生物碱、原小檗碱型生物碱和异喹啉型生物碱等[3，7]。生物碱由于其抑菌[8]、消炎、镇痛、抗肿瘤[9]及促进免疫功能等生物活性，成为近年来研究的热点之一。有关生物碱的提取方法有多种[10]，利用超声技术可以缩短提取时间、提高提取率，并且无需加热，提高了热敏性生物碱的提取率，且对其生理活性基本无影响。本文探索超声法提取海南地不容总生物碱的最优工艺，以盐酸小檗碱为对照品，采用紫外分光光度法测定总生物碱的含量，为进一步研究和开发海南地不容的药用价值提供基础研究数据。

1 材料与方法

1.1 材料

地不容药材采自海南兴隆，经海南医学院曾念开教授鉴定为防己科千金藤属（Menispermaceae Stephania）海南地不容（S. hainanensis）块根，晾干，粉成细粉，备用。

试验所用仪器：KQ-200KDE型高功率数控超声清洗器（昆山超声仪器有限公司）、RE-201D旋转蒸发仪（上海科升仪器有限公司）、UV1600型紫外可见分光光度计（北京瑞利分析仪器有限公司）、B210S分析天平（北京赛多利斯有限公司）、PHS-3C型酸度计（上海精密科学仪器有限公司）；试剂：盐酸小檗碱（上海源叶生物科技有限公司，批号B21449）；溴甲酚绿（天津市鼎盛鑫化学试剂公司），柠檬酸（天津大茂化学试剂厂），柠檬酸钠（天津大茂化学试剂厂），三氯甲烷，无水乙醇、氢氧化钠均为国产分析纯，水为蒸馏水。

1.2 方法

1.2.1 相关溶液配制

1.2.1.1 对照品溶液配制

精密称定在110℃干燥至恒重的盐酸小檗碱20 mg，置于25 mL容量瓶中，加蒸馏水至刻度线，搖匀；精密量取上述溶液2.5 mL于10 mL容量瓶中，加蒸馏水至刻度线，摇匀，得200 μg/mL的对照品溶液。

1.2.1.2 显色液和缓冲液的配制

参照文献[6]配制溴甲酚绿酸性染料溶液以及pH=5.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液。

1.2.1.3 供试品溶液配制

精密称定海南地不容粉末2.0 g，分别加入70%乙醇，120 W功率，超声提取30 min，提取2次，浓缩后经氯仿提取，于50 mL容量瓶中定容，摇匀，低温冷藏储存，备用。

1.2.2 方法学考察

1.2.2.1 吸收波长的选择

精密量取盐酸小檗碱对照品溶液与供试品溶液各0.3 mL，置分液漏斗中，加柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液5 mL，溴甲酚绿溶液2 mL，摇匀，加入氯仿10 mL，充分振摇，静置1 h，分出氯仿层后，于300～600 nm波长范围内进行扫描，同时以氯仿作为空白参比液。

1.2.2.2 线性关系考察

精密量取盐酸小檗碱对照品溶液0.1、0.2、0.3、0.5、0.7、0.9 mL加水0.9、0.8、0.7、0.5、0.3、0.1 mL按1.2.2.1项操作，充分振摇后，静置1.5 h，分出氯仿层，在418 nm处测定吸光度值，同时以氯仿作为空白对照。

1.2.2.3 稳定性考察

取对照品0.3 mL，按1.2.2.1项操作后在，室温条件下密闭放置，分别在0、10、15、30、60、90、120 min时测定于418 nm处吸光度。

1.2.2.4 精密度试验

精密量取对照品溶液0.3 mL，按1.2.2.1项操作后，平行测6次，以空白溶液作为参比。

1.2.2.5 重复性试验

取0.3 mL供试品溶液6份，按1.2.2.1项操作后，依次测定吸光度值，以空白溶液作为参比。

1.2.2.6 加标回收试验

取0.3 mL供试品溶液6份，分别加入对照品溶液0.1 mL，按1.2.2.1项操作后，分别测定吸光度值。

1.2.3 提取工艺筛选

分别考察乙醇的体积分数、提取时间、提取功率、提取次数和料液比对总生物碱提取率的影响，并在此基础上设计正交试验确定超声提取法的最优工艺。

2 结果与分析

2.1 波长的选择

取对照品溶液与空白参比溶液分别于300～600 nm波长范围内进行扫描。结果表明：盐酸小檗碱对照品溶液在418 nm处有最大吸收峰，而空白参比溶液在418 nm处没有吸收，故本实验选定418 nm为测定波长。

2.2 线性关系考察

精密量取对照品溶液于418 nm处测定吸光度，以吸光度值（A）纵坐标，浓度（μg/mL）为横坐标绘制标准曲线，如图1所示，线性回归方程为A=0.077+0.051 C，相关系数r=0.999 4。结果表明：盐酸小檗碱在0.0～18.0 μg/mL范围内线性关系良好。

2.3 方法学考察

2.3.1 稳定性试验

取对照品溶液分别在0、15、30、60、90、120 min平行测定6次后，得其RSD=1.70%（n=6）。结果表明：小檗碱在0～120 min内可以保持稳定，满足试验的要求。

2.3.2 精密度试验

取对照品溶液平行测定6次后，得其RSD=0.70%（n=6），结果表明仪器精密度良好，符合试验的要求。

2.3.3 重复性试验

取供试品溶液平行测定6次后，得其RSD=1.56%（n=6），表明重现性良好，符合试验的要求。

2.3.4 加标回收试验

如表1所示，回收率为96.76%～102.60%，平均回收率为99.03%，RSD=2.38%（n=6）。结果表明，本实验方法具有良好的回收率，满足试验的要求。

2.4 单因素试验

2.4.1 乙醇体积分数对提取效果的影响

由图2-A可知，随着乙醇体积分数的增大，海南地不容中总生物碱的提取率先降低后逐渐增大，在乙醇体积分数为80%时提取率有最大值。生物碱与乙醇体积分数呈非线性关系，乙醇浓度过高或过低都不利于生物碱的提取，且浓度过高，提取成本也明显增加，因此，选定60%、70%、80%作为正交的3个合理水平。

2.4.2 超声功率对提取效果的影响

由图2-B可知，随着超声功率的增大，总生物碱的提取率先增大，随后开始减小，再增大。在超声功率为200 W时提取率达到最大值。从节能的角度考虑，超声功率不宜过高，所以选定120、160、200 W为正交的3个合理水平。

2.4.3 超声时间对提取效果的影响

由图2-C可知，随着超声时间的增加，总生物碱的提取率逐渐增大，在超声时间为40 min时提取率有最大值，之后，超声时间对提取率的影响不大。因此，选定30、40、50 min作为正交的合理水平。

2.4.4 提取次数对提取效果的影响

由图2-D可知，当提取次数超过2次后，总生物碱的提取率趋于平稳。从经济及效率的角度考虑，提取次数为2次较为理想，不再进行优化。

2.4.5 提取料液比的影响

由图2-E可知，随着料液比增大，总生物碱的提取率先增大后减小，当料液比为1∶20时，达到最大值，再增加料液比没有增加提取率，反而造成试剂的浪费。因此，选定料液体积比1∶15、1∶20、1∶25作为正交的合理水平。

2.5 正交设计试验

根据单因素实验结果，优选4个因素设计正交试验，因素与水平见表2。正交试验结果见表3，方差分析见表4。

对表3结果进行直观分析和方差分析可知，极差大小显示各因素的影响作用依次为乙醇体积分数（A）>提取功率（C）>提取时间（B）>料液比（D），乙醇的体积分数（A）和提取功率（C）对地不容中总生物碱的提取有显著影响，提取时间（B）和料液比（D）对提取影响较小。从直观分析图中可看出，时间因素B1和B3对提取影响不是很明显，从节能和效率的角度考虑选择B1较为理想。因此，综合直观分析和方差分析的结果，确定海南地不容中总生物碱的最优提取工艺为：A3B1C2D2，即乙醇的体积分数为80%，超声提取30 min，功率为160 W，料液比为1∶20，提取2次。

2.6 工艺验证及总生物碱含量测定

为进一步考察最优工艺的稳定性，精密称取地不容粉末2.0 g，3份，按照最優工艺提取得供试品溶液，测得海南地不容中总生物碱含量平均为4.67%，RSD=1.58%（n=6）。

2.7 回流法提取生物碱

精密称定地不容粉末约2.0g，3份，置于圆底烧瓶中，用30mL乙醇加热回流2h，提取2次。过滤，用氯仿萃取，显色，定容，测定总生物碱的含量为2.58%，RSD=2.01%（n=3）。

3 讨论

本研究采用超声法提取海南地不容中的总生物碱，通过单因素试验及正交试验法确定超声提取总生物碱的最优工艺为乙醇的体积分数为80%，超声提取30 min，功率为160 W，料液比为1∶20，提取2次。与加热回流提取法比较，超声法操作简单、用时少、节能环保、提取效率高。采用酸性染料比色法于紫外-可见分光光度计上测定总生物碱含量，由于氯仿可有效萃取生物碱-溴甲酚绿离子对，因此选定为萃取剂，但在测定吸光度值时，氯仿极易挥发，故应快速测定，以免影响测量结果。本研究建立的测量方法简单、灵敏度高、重现性好、测定结果准确，可用于地不容中总生物碱的含量测定。本研究探索的超声提取方法可为进一步开发和利用海南地不容的药用价值提供科学依据。

参考文献

[1] 中国科学院中国植物志编辑委员会. 中国植物志30（1）卷[M]. 北京：科学出版社，1996：53-53.

[2] 庞玉新，王祝年主编，海南岛天然抗癌本草图鉴第1卷[M]. 北京：中医古籍出版社，2009.

[3] 沈晓静，董建伟，梅瑞峰. 地不容生物碱成分研究[J]. 化学研究与应用，2016，28（12）：1 730-1 734.

[4] 程 彬，戴 华，白丽丽. 海南粪箕笃根茎中总生物碱含量的测定[J]. 安徽农业科学，2015（16）：67-68.

[5] 储美娜，朱 毅，董 志，等. 海南地不容总碱的镇痛抗炎作用及毒性观察[J]. 中国热带医学，2011，11（6）：719-721.

[6] 刘秀萍，黄祥卫，刘 炜. 小叶地不容中总生物碱含量的测定[J]. 海南师范大学学报，2011，24（2）：174-175.

[7] 马养民. 千金藤属植物化学成分研究[J]. 西北林学院学报，2004，19（3）：125-130，182.

[8] 曹 鹏，张紫薇，李 滢，等.异喹啉类生物碱抑菌活性及抑菌机制研究进展[J]. 中国中药杂志，2014，41（14）：2 600-2 606.

[9] 宫 爽，孙佳明，田淋淋，等. 天然药物中生物碱类成分抗肿瘤活性[J]. 吉林中医药，2014，34（9）：927-931.

[10] 喻朝阳，王晓琳. 生物碱提取与纯化技术应用进展[J]. 化工进展，2006，25（3）：259-263.