小鼠脑缺血再灌注模型的优化及其效果评价

刘震乾，张清秀，魏秀娥，高红，陈默，荣良群

(徐州医科大学 第二附属医院,江苏 徐州 221006)

·论 著·

小鼠脑缺血再灌注模型的优化及其效果评价

刘震乾，张清秀，魏秀娥，高红，陈默，荣良群

(徐州医科大学 第二附属医院,江苏 徐州 221006)

脑缺血再灌注； 神经功能评分； 脑梗死体积比； 小鼠

随着对脑缺血再灌注损伤及其防治机制研究的深入，动物模型模拟脑缺血再灌注的实验技术越来越受关注[1]。目前小鼠脑缺血再灌注线栓模型主要都是经颈外动脉进栓，最终要结扎颈外动脉[2]，然而结扎颈外及其分支可以导致咀嚼肌受损、术后小鼠体重下降、神经功能恢复缓慢、神经功能缺损评分与实际脑梗死范围相差较大等不良后果[3]，因此本研究采用结扎颈内动脉(LICA)术式对小鼠脑缺血再灌注模型进行了改进，并对其造模效果进行了评价。

1 材料与方法

1.1 实验材料与试剂

1.2 动物分组

所有小鼠于屏障环境内饲养3 d以上，保持室温25 ℃、相对湿度55%，采用随机分组的原则将小鼠随机分为假手术组(Sham组)、LICA组、结扎颈外动脉组(LECA组)3组，每组30只。

1.3 小鼠脑缺血再灌注模型制备

LICA术式：(1)麻醉：小鼠腹腔注射10%水合氯醛，剂量为3.3 μl·g-1。(2)血管分离、打结：将小鼠仰卧位固定，行颈部正中切口，钝性分离出右侧颈动脉分叉(carotid bifuracation，CB)及其附近的颈总动脉(common carotid artery，CCA)、颈外动脉(external carotid artery，ECA)、颈内动脉(internal carotid artery，ICA)、枕动脉(occipital artery，OA)、翼腭动脉(pterygopalatine artery，PPA)和ICA近颅段，用缝合线在CCA、PPA以及ICA分叉处和ICA近颅端打活结(图1a)。(3)进栓：在ICA分叉下方剪一小口，将硅胶线栓由剪口送入ICA，当线栓进入深度距离CB 9～10 mm时感到阻力，用预留于ICA的活结固定线栓，结扎ICA剪口处残端，松开CCA、PPA处的活结(图1b)。(4)拔栓：进栓80 min后将线栓拔出，结扎ICA近颅残端。(5)缝合及术后护理：缝合小鼠颈部皮肤，并用碘伏消毒伤口。手术结束后，将小鼠放在25 ℃保温毯上，小鼠苏醒后放入屏障环境饲养笼中。整个LICA术式流程如图2。

图1 LICA术式进栓模式图

参照Longa等[4]LECA术式：(1)麻醉：与LICA术式相同。(2)分离血管：将小鼠仰卧位固定，行颈部正中切口，钝性分离右侧胸锁乳突肌内侧缘分离出右侧CCA，于右侧舌骨下分离出右侧ECA，在CB处分离出右侧ICA。(3)进栓：用缝合线在CCA近心端打一活结以防渗血，用微动脉夹夹闭ICA，于ECA的嘴侧与颈动脉分叉中间端剪一小口，将线栓经该剪口顺颈外动脉插入，结扎并电灼游离ECA的嘴侧端，将ECA游离段拉向外上方使之与ICA走向平行，将线栓顺势缓慢送入ICA，当线栓进入深度在9～10 mm时感到阻力，用预留缝合线固定线栓。(4)拔栓：80 min后将线栓拔出，同时结扎ECA游离端，松开CCA处活结。(5)缝合及术后护理：同LICA术式。Sham组仅作各个血管分离。

图2 小鼠脑缺血再灌注模型LICA术式流程图 a.小鼠麻醉后仰卧位固定，行颈部正中切口； b.体视镜10倍镜下，钝性分离出右侧CB处的CCA、ICA、ECA； c.体视镜10倍镜下，钝性分离OA、PPA、ICA进颅段，于CB上方的CCA处打一活结； d.体视镜40倍镜下，于PPA、ICA近颅段打活结，在ICA进颅段松结上方剪口并进栓； e.体视镜10倍镜下，调整进栓深度并用活结固定线栓，线栓黑色标记提示进栓深度为距离CB以下9～10 mm，结扎剪口近心端ICA残端，松开CCA、PPA处活结； f.体视镜40倍镜下，进栓80 min后将线栓拔出，结扎ICA残端

1.4 神经功能缺损评分(neurological severity scores，NSS)

参考Menzies等[5]方法，分别于术后24 h、72 h、1周对各组小鼠进行NSS评分，最高分为18分(每项得分系不能完成要求执行的任务或缺少一项反射)，13～18分为严重损伤，7～12分为中度损伤，1～6分为轻度损伤。

1.5 测定小鼠脑梗死体积比

1.6 模型成功率及死亡率的比较

术后24 h分别以NSS 6分以上、TTC染色出现梗死病灶作为评价模型成功的标准，计算模型成功率。分别在术后24 h、72 h、1周计数各组小鼠的死亡数。

1.7 小鼠一般生存状态评价

分别在术前及术后24 h、72 h、1周对小鼠的体重进行称量并与术前体重进行比较，体重变化率(%)=(术前体重-术后各时间点体重)/术前体重×100%。同时对各组小鼠行Clark一般功能损伤评分[7]。

1.8 统计学处理

计量资料用均数±标准差表示，两组间比较符合正态分布及方差齐性应用SPSS 10.0软件进t检验分析，多组间比较采用方差分析，计数资料采用卡方检验，P<0.05表示差异具有统计学意义，用Spearman等级相关分析相关性。

2 结 果

2.1 小鼠脑缺血再灌注模型成功率比较

术后24 h分别以NSS>6分、TTC染色出现明显白色梗死病灶作为判断模型成功的标准，如出现暗红色病灶属造模失败。以NSS结果判断各组造模成功率分别为0(Sham组，n=15)、93.3%(LECA组，n=15)、86.7%(LICA组，n=15)，NSS评分后再对各组小鼠断头、取脑、切片行TTC染色，TTC染色出现明显白色梗死病灶判断各组造模成功率分别为0(Sham组，n=15)、73.3%(LECA组，n=15)、93.3%(LICA组，n=15)，TTC染色可作为实际造模成功的判断方法。以上提示采用LICA术式实际造模成功率(93.3%)更高，NSS评分判断造模成功率(86.7%)与TTC染色判断造模成功率(93.3%)具有较好的一致性。

2.2 小鼠脑缺血再灌注术后24 h脑梗死体积比与行为学相关性分析

进一步探讨LICA术式下小鼠行为学评分与实际脑损伤程度的相关情况，Sham组小鼠TTC染色脑片呈均匀红色，未见白色梗死病灶，脑梗死体积比为0；LECA组小鼠脑梗死体积比为(22.6±2.1)%，LICA组小鼠脑梗死体积比为(23.0±1.6)%，与Sham比较差异均有统计学意义(P<0.05)，LICA组与LECA组比较差异无统计学意义P>0.05。术后24 h Sham组NSS为0，LECA组NSS为12.2±2.7，LICA组NSS为9.5±2.2，与Sham组比较差异均有统计学意义(P<0.05)，LICA组与LECA组比较差异有统计学意义(P<0.05)。以上提示采用LICA术式不仅可以出现明显的梗死病灶，同时可降低手术引起的神经功能损伤。

在术后24 h，NSS与脑梗死体积相关性分析中，LECA组NSS评分结果与脑梗死体积百分比无相关性(r=0.258，P>0.05)；LICA组NSS评分结果与脑梗死体积百分比显著相关(r=0.766，P<0.01)。以上提示与LECA术式相比，采用LICA术式小鼠NSS与小鼠实际脑梗死体积具有显著相关性。

2.3 术后不同时间小鼠体重变化率

分别于术前及术后24 h、72 h、1周测量小鼠体重。各组小鼠体重变化率：Sham组(n=15)各时间点为0，LECA组(n=15)24 h、72 h、1周分别为(7.8±0.34)%、(16.1±0.39)%、(9.1±0.3)%，LICA组(n=15)分别为(4.8±0.6)%、(9.7±0.2)%、(3.2±0.7)%。术后各时间点3组间小鼠体重变化率比较差异均有统计学意义(P<0.05)，提示应用LICA术式减少了小鼠术后各时间点体重的减轻情况。

2.4 术后不同时间小鼠死亡率的变化

分别于术后24 h、72 h、1周对小鼠的死亡情况进行计数，LECA组小鼠在术后3个时间点死亡率均高于LICA组，提示与LECA术式相比采用LICA术式降低了术后3个时间点小鼠的死亡率(图3)。

2.5 术后不同时间点小鼠Clark一般功能损伤评分

临床上可将缺血性脑卒中患者的神经功能损伤情况划分为一般功能损伤和局灶性功能损伤。一般功能损伤可以反映患者的生命状态和神经功能损伤的整体情况，Clark一般功能损伤评分正是从小鼠整体神经功能损伤情况来评价小鼠的一般生存状态。本研究对小鼠术后24 h、72 h、1周行Clark一般功能损伤评分。在术后各时间点LICA组小鼠Clark一般功能损伤评分与LECA组相比差异均有统计学意义(P<0.05)，提示采用LICA术式较之LECA术式可以提高小鼠的一般生存状态，减少手术操作因素引起的一般功能损伤(图4)。

图3 3组小鼠术后24 h、72 h、1周死亡率的变化

3 讨 论

近年来随着基因工程研究的飞速发展，转基因大鼠已有一定应用[8]，但小鼠与人类基因组具有较高的同源性[9]，将小鼠作为脑缺血再灌注的模型动物越来越受到关注。本研究着重探讨优化小鼠脑缺血再灌注模型的方法，并对造模方法进行比较及评价。然而在动物实验过程中，诸多因素影响着小鼠脑缺血再灌注模型制作的成功与否，现将LICA术式操作注意事项总结如下：

目前LECA术式已经得到了很好的应用，考虑到该术式对ECA及其分支的破坏作用从而影响小鼠进食及神经行为学评分，国内有人提出LECA术式的简化法[11]，此法虽然操作简便但结扎一侧CCA对血流动力学产生的影响不可忽略，同时仅靠Willis环实现再灌注并不能真正模拟缺血再灌注病理生理过程，尤其是不同小鼠品系健侧代偿能力差别较大，对代偿较差的小鼠品系而言，手术侧ECA、PPA灌流皆受影响，PPA受损后可导致吞咽困难、视力下降甚至眼盲，死亡率较高。因此此法很难应用于脑缺血再灌注损伤的系统性研究。本研究所使用的LICA术式实现对动物模型优化的原因之一正是通过减轻了对PPA的损伤。

手术过程中我们发现PPA有一定的对侧代偿能力，应用经典的LECA术式，PPA可以通过线栓的尾部对大脑中动脉(MCA)及其周围分支动脉实现代偿，最终导致模型一致性较差甚至造模失败。国内曾有人提出在LECA经典术式的基础上结扎游离PPA[12]，而PPA的分支包括眼动脉、翼管动脉、咽动脉等重要分支动脉，结扎游离PPA势必会对小鼠一般功能状态造成严重影响。因此本研究所采用的LICA术式，既避免了PPA的复灌，又避免了对PPA的损伤。

综上所述，本研究探讨了LICA术式对小鼠脑缺血再灌注损伤模型的优化，通过比较我们发现,LICA术式减少了对颅内外血管的破坏，小鼠一般功能状态受损较小，生存率得到改善，为研究神经元的死亡、再生修复以及药物的干预作用提供一种了更为稳定可靠的造模方法。

Optimization and evaluation of cerebral ischemia reperfusion model in mice

(TheSecondAffiliatedHospitalofXuzhouMedicalUniversity,Xuzhou221006，China)

cerebral ischemia reperfusion; neurological function score; cerebral infarction volume ratio; mice

国家自然科学基金青年基金项目(81301120)；江苏省高校自然科学基金面上项目(13KJB320027)；国家自然科学基金面上项目(81671149)；江苏省自然科学基金面上项目(BK20161167)

A