NECA对大鼠离体缺血再灌注心肌细胞自噬的调控作用

王晴，周岩，韩会，汪凤兰，邢凤梅

(华北理工大学护理与康复学院，河北唐山 063000)

NECA对大鼠离体缺血再灌注心肌细胞自噬的调控作用

王晴，周岩，韩会，汪凤兰，邢凤梅

(华北理工大学护理与康复学院，河北唐山 063000)

目的 观察非选择性腺苷受体激动剂5′-N-乙基酰胺基腺苷(NECA)对离体心肌缺血再灌注大鼠细胞自噬的调控作用。方法 将42只Wistar大鼠随机分为Sham组、I/R组、NECA组，各14只。Sham组心脏只穿线但不结扎缺血，用Kerbs-Henseleit缓冲液持续灌流170 min。I/R组、NECA组使用Langendorff装置制备大鼠离体心肌缺血再灌注损伤模型，且NECA组再灌注前分别给予含NECA的灌流液。透射电镜观察各组大鼠心肌超微结构的改变；Western blotting法检测自噬标志蛋白Beclin-1、LC3的表达。结果 Sham组、NECA组透射电镜下未见自噬体存在，但在I/R组可见多处典型的自噬现象。与Sham组相比，I/R组Beclin-1蛋白表达高、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ高(P均<0.05)。与I/R组相比，NECA组Beclin-1蛋白表达低、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ低(P均<0.05)。结论 NECA可通过降低大鼠心肌细胞自噬发挥心肌保护作用。

5′-N-乙基酰胺基腺苷；心肌缺血再灌注损伤；自噬

心肌缺血再灌注损伤涉及多种细胞分子机制，包括炎症反应、钙超载、线粒体损伤、细胞凋亡以及自噬等[1]。自噬是一种细胞保护机制，正常情况下细胞的自噬水平较低。但在心肌缺血、再灌注过程中，心肌细胞自噬水平显著上调，过度自噬导致心肌细胞死亡，抑制过度的自噬活动可有效减轻心肌细胞的损伤[2]，因此自噬成为研究心肌缺血再灌注损伤机制的重要靶点。NECA是一种非选择性腺苷受体激动剂，能够通过缩小梗死面积、减轻炎症反应、改善左心室功能来保护受损的心肌[3]。已有研究[4]证实，NECA可有效减少心肌缺血再灌注损伤，但保护作用机制尚不清楚。Beclin-1、LC3是心肌细胞自噬标志蛋白。2015年8月～2016年3月,本研究观察了NECA对大鼠离体缺血再灌注心肌细胞Beclin-1、LC3表达及心肌超微结构的影响，探讨NECA对大鼠离体缺血再灌注心肌细胞自噬的调控作用，为临床急性心肌梗死的防治提供依据。

1 材料与方法

1.1 动物、主要试剂和仪器 SPF级健康成年雄性Wistar大鼠42只，体质量250～300 g，由华北理工大学实验动物中心提供。生长环境：恒温(18～24 ℃)、恒湿(45%～50%)、明暗交替各12 h，严格遵守国家颁布的实验动物管理条例和实验动物管理实施细则。NECA购自英国TOCRIS公司，BCA蛋白浓度测定试剂盒、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒购自Beyotime生物技术研究所，兔源Beclin-1单克隆抗体、兔源LC3B单克隆抗体、兔源β-tubulin单克隆抗体购自美国Cell Signaling Technology，辣根过氧化物酶标记抗兔IgG(H+L)购自美国KPL公司。Langendorff灌流设备、多道生理信号采集设备购自四川成都仪器厂，H-7650透射电子显微镜购自日本Olympus公司。

1.2 大鼠离体心肌缺血再灌注损伤模型制备方法 采用Langendorff心脏灌注模型法构建大鼠离体心脏心肌缺血再灌注损伤模型。将大鼠腹腔注射10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)麻醉，仰卧位固定，开胸后迅速取出心脏悬挂在Langendorff灌流设备上进行主动脉逆流。将连有压力传感器的乳胶球囊放入左心室中，通过调节球囊内溶液容量使左室舒张末压保持在5～10 mmHg。待心脏稳定20 min后结扎左冠状动脉前降支，造成心脏局部缺血。30 min后松开，使缺血部位再灌注。

1.3 实验分组及处理 将42只Wistar大鼠随机分为Sham组、I/R组、NECA组各14只。Sham组心脏只穿线但不结扎，用Kerbs-Henseleit缓冲液持续灌流170 min。其他2组制备大鼠离体心肌缺血再灌注损伤模型。I/R组再灌注2 h。NECA组再灌注2 h，于再灌注前5 min给予含0.1 μmol/L NECA的灌流液，至再灌注30 min时结束。

1.4 各组大鼠心肌超微结构观察 取适量心肌组织，放于4 ℃的2.5%戊二醛溶液前固定，用磷酸盐缓冲液清洗后再用1%锇酸固定液进行后固定。再次清洗后脱水，用100%丙酮与包埋液浸透包埋，聚合烤片，切片，滴加醋酸铀染液和枸橼酸铅染色液进行双染色，通过透射电镜观察大鼠心肌超微结构及有无自噬现象发生。细胞发生自噬的金标准：在电镜下可观察到心肌细胞在双层膜或单层膜结构内出现包含细胞器的自噬泡[5]。

1.5 各组大鼠心肌细胞Beclin-1、LC3蛋白表达检测 采用Western blotting法。取适量心肌组织，提取蛋白，利用酶标仪计算待测蛋白浓度，进而确定蛋白上样量，将蛋白分装、变性。制备SDS-PAGE凝胶，上样，电泳并转膜。将转入蛋白质的PVDF膜置于5%脱脂牛奶中封闭。分别滴加兔源Beclin-1、LC3B一抗，4 ℃水平摇床过夜，用TBST洗膜，加入相对应的酶标二抗，37 ℃孵育1～2 h。再次洗膜后进行显色，以β-tubulin为内参，用Image J软件分析蛋白条带的灰度值，计算Beclin-1蛋白相对表达量及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ。

2 结果

2.1 各组大鼠心肌超微结构比较 Sham组肌丝排列致密规则，肌节形态完整，嵴排列整齐。I/R组大部分肌丝断裂、缺失，肌节挛缩，嵴排列稀疏甚至断裂。NECA组的损伤较I/R组减轻，肌丝排列较规则，肌节轻度挛缩。Sham组、NECA组没有自噬体存在，但I/R组存在多处典型的自噬现象，可见正在吞噬或者正在消化溶解的包裹着线粒体及其他细胞器的单层膜结构的自噬溶酶体。

2.2 各组大鼠心肌细胞Beclin-1蛋白、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比较 见表1。

表1 各组大鼠心肌细胞Beclin-1蛋白、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比较

注：与Sham组相比，*P<0.05；与I/R组相比，#P<0.05。

3 讨论

自噬是一种高度保守的细胞降解过程，可通过溶酶体降解内容物来实现细胞本身代谢平衡[1]。自噬对细胞的影响是双向的，适度的自噬可以帮助细胞对受损蛋白质与细胞器进行分解和再利用，但自噬程序过度激活会导致细胞死亡[6]。目前自噬在心肌缺血再灌注损伤中的研究结果不一致，通常认为，自噬在心肌缺血阶段起保护作用，但在再灌注阶段会加重心肌损伤[2]。有研究[7]表明，心肌缺血再灌注损伤时心肌细胞呈现出强烈的自噬特性，且在再灌注期间，自噬水平与心肌损伤程度呈正相关。因此，自噬可能成为防治心肌缺血再灌注损伤的切入点。

目前，NECA已成为治疗心肌梗死最有前景的药物之一，但由于其保护作用机制尚不明确，在临床上应用受限[6]。我们的前期实验表明，NECA可有效减少心肌缺血再灌注所导致的细胞凋亡和内质网应激。然而关于NECA对心肌缺血再灌注时自噬活动的影响未见报道，因此本研究重点探讨NECA对心肌缺血再灌注自噬调控的机制。本实验通过建立大鼠急性心肌缺血再灌注损伤模型，观察到I/R组心肌细胞损伤严重，有多处典型的自噬现象，说明心肌缺血再灌注损伤可以提高心肌细胞的自噬水平，这与Sciarretta等[1]的研究结果一致，证实了再灌注阶段的过度自噬会加重心肌损伤。NECA组心肌细胞损伤明显减轻，没有自噬体的形成，仅有部分线粒体轻度水肿，推测NECA可能通过抑制心肌细胞的过度自噬而发挥心肌保护作用。

Beclin-1是一种关键的自噬蛋白，是自噬发生的始动因子，可调节自噬体的形成，直接反映自噬的发生程度[8]。有研究[1]证实，在心肌缺血再灌注损伤期间，Beclin-1表达升高标志自噬程序被过度激活，进而诱发细胞死亡。LC3是自噬相关蛋白，是自噬起始阶段的一种特殊的分子标志物，LC3Ⅰ为未脂质化的非活性状态，LC3Ⅱ为脂质化的活性状态，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ反映自噬的激活状态[9]。研究[5]发现，心肌缺血再灌注损伤时LC3Ⅱ表达明显上调，进而诱导细胞自噬的发生。本研究结果显示，与Sham组相比，I/R组Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ高，说明缺血再灌注能增加自噬的发生。与I/R组相比，NECA组Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ低，说明NECA可通过降低缺血再灌注引起的大鼠心肌细胞自噬增高而发挥心肌保护作用。

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河北省医学科学研究重点课题计划(20090548)。

邢凤梅(E-mail: 598461347@qq.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.22.009

R331.3

A

1002-266X(2017)22-0028-03

2016-12-16)