电针刺激天枢穴对急性重症胰腺炎大鼠肺组织AQP-1表达的影响

聂容荣，潘泓华，文辉，杨华，曾伟星，谭亲友，江伟，符文彬，齐立

(1中国人民解放军第181中心医院，广西桂林 541001；2桂林医学院附属医院；3广东省中医院)

电针刺激天枢穴对急性重症胰腺炎大鼠肺组织AQP-1表达的影响

聂容荣1,2，潘泓华1，文辉2，杨华2，曾伟星1，谭亲友2，江伟2，符文彬3，齐立1

(1中国人民解放军第181中心医院，广西桂林 541001；2桂林医学院附属医院；3广东省中医院)

目的 观察电针刺激天枢穴对急性重症胰腺炎大鼠肺组织AQP-1表达的影响。方法 将60只雄性SD大鼠随机分为正常对照组、正常电针组、模型组、电针模型组，各15只。正常对照组、正常电针组不做任何处理；模型组、电针模型组逆行胰胆管注射5%牛磺胆酸钠制备急性重症胰腺炎模型。正常电针组、电针模型组在模型制备成功2 h后，电针刺激大鼠天枢穴。造模8 h后，采用RT-PCR和免疫组化法分别检测各组大鼠肺组织中AQP-1 mRNA、蛋白。结果 模型组大鼠肺组织AQP-1 mRNA、蛋白表达低于正常对照组和正常电针组(P均<0.05)，电针模型组大鼠肺组织AQP-1 mRNA、蛋白表达高于模型组(P均<0.05)，正常对照组与正常电针组大鼠肺组织AQP-1 mRNA、蛋白表达比较差异无统计学意义。结论 电针刺激天枢穴可升高急性重症胰腺炎大鼠肺组织AQP-1的表达。

电针刺激；天枢穴；急性重症胰腺炎；胰源性肺损伤；水通道蛋白-1

急性重症胰腺炎(SAP)病情凶险，且常并发急性肺损伤(ALI)加重病情。ALI主要病理特征为肺血管内皮细胞及肺泡上皮细胞广泛性损伤，全身炎症反应综合征在肺部表现为肺部弥漫性渗出和难以用单纯吸氧纠正的低氧血症[1]。此种胰源性肺损伤的终末结局为呼吸窘迫综合征，病死率高达50%～90%[2]，但其发病机制并未完全阐明。水通道蛋白(AQP)作为膜主体内在蛋白家族成员，具有使细胞膜水通透力提升的功能，能够提供快速液体转运的途径。目前有关AQP在ALI或肺部炎症中作用的研究主要集中在AQP-1和AQP-5。AQP-1主要在气道周围毛细血管、淋巴管及肺泡毛细血管内皮细胞和脏层胸膜间皮细胞上表达，参与多种肺损伤性炎症病理过程[3,4]。中医理论认为，肺与大肠相表里，肺为娇脏，阳明腑实，大便不通极易导致肺失宣降而致肺损伤。电针对机体的免疫应激以及炎性因子的释放起调节作用[5]。天枢穴属于足阳明胃经经穴，同是大肠腑的募穴，“腑病取募”，电针刺激天枢穴有疏通肠腑、理气通便作用。前期研究[6]表明，电针刺激可减轻肺损伤。2014年12月～2016年12月，本研究观察了电针刺激天枢穴对SAP大鼠肺组织AQP-1表达的影响，探讨电针刺激天枢穴减轻ALI的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物、试剂与仪器 健康清洁级雄性SD大鼠60只，体质量100～120 g，分笼饲养，自由饮水，喂标准颗粒饲料，室温(20±2)℃，动物及饲料购自桂林医学院实验动物中心。AQP-1抗体、免疫组化试剂盒购自北京中山生物技术有限公司；RT-PCR试剂盒购自成都溶海生物技术有限公司。本研究经桂林医学院附属医院伦理委员会批准。

1.2 动物分组及模型制备 将60只模型大鼠随机分为正常对照组、正常电针组、模型组、电针模型组共4组，每组15只。所有大鼠术前禁食12 h。模型组和电针模型组大鼠采用20 g/L水合氯醛腹腔注射进行麻醉，腹部剃毛，消毒术区皮肤，无菌条件下经正中切口入腹。在10倍手术显微镜下以直径为0.45 mm聚乙烯导管经胰腺胆管十二指肠乳头开口入胰胆管，同时在胆管出肝门处用小动脉夹夹闭，用微量泵以0.04 mL/min速度稳定匀速地逆行注射5%牛磺胆酸钠(0.1 mL/100 g)，3～5 min内注射完，后用动脉夹夹闭近十二指肠的胰胆管10 min。待胰腺组织出现肉眼可见的出血水肿后，于胆胰管汇入十二指肠处、穿刺点近侧端予以11-0丝线结扎，撤除2个动脉夹、还纳十二指肠入腹，逐层关腹[7]。正常对照组、正常电针组不做任何处理。

1.3 电针刺激方法 模型制备成功2 h后，电针刺激正常电针组和电针模型组大鼠天枢穴。天枢穴定位采用拟人比照法，取大鼠胸腹正中线上，以剑突为一定位点，以耻骨联合上缘为另一定位点，两者连线的上2/3与下1/3的交点处旁开5 mm为天枢穴。用特制鼠架将大鼠固定后，穴位周围剪去腹毛，皮肤常规消毒，用毫针针刺5 mm，接HANS-200A型电针仪，电流强度为0.8～1.3 mA，采用疏密波，2 Hz/15 Hz，治疗15 min。

1.4 肺组织AQP-1 mRNA检测 采用RT-PCR法。各组大鼠均于造模8 h后剖杀，取右肺组织，提取总RNA。AQP-1上游引物序列为5′-ATGGCCAGCGAAATCAAGAAG-3′，下游引物序列为5′-GATATCATCAGCATCCAGGTC-3′。β-actin引物序列上游为5′-GATATCGCTGCGCTCGTCGTC-3′，下游为5′-CATGAGGTAGTCTGTCAGGTC-3′。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min，98 ℃变性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸10 s，循环30次，72 ℃延伸1 min，最后降至4 ℃结束反应。PCR产物在琼脂糖凝胶中电泳后采用凝胶成像系统记录分析。以AQP-1 mRNA与内参β-actin电泳条带灰度值之比，作为AQP-1 mRNA的相对表达量。

1.5 肺组织AQP-1蛋白检测 采用免疫组化法。取左肺组织常规脱水、包埋制成蜡块。PBS代替一抗作为阴性对照，采用SP法按照免疫组化试剂盒说明书操作。每张切片选择5个高倍镜视野(×400)，应用图像分析系统进行灰度扫描，实验重复3次取均值。

2 结果

模型组大鼠肺组织AQP-1 mRNA、蛋白表达低于正常对照组和正常电针组(P均<0.05)，电针模型组大鼠肺组织AQP-1 mRNA、蛋白表达高于模型组(P均<0.05)，正常对照组与正常电针组大鼠肺组织AQP-1 mRNA、蛋白表达比较差异无统计学意义，见表1。

表1 各组大鼠肺组织AQP-1 mRNA、蛋白表达比较

注：与正常对照组比较，aP<0.05；与正常电针组比较，bP>0.05；与模型组比较，cP<0.05。

3 讨论

SAP患者一旦并发ALI其病情将迅速恶化，病死率高，预后较差，是临床上比较棘手的疾病[8]。有研究[9]表明，细胞因子与炎症介质过度释放会引起胰源性肺损伤。AQP-1在肺微血管内皮细胞中含量相对较高[10,11]，肺水肿的严重程度与AQP-1表达水平呈负相关[12,13]。上述研究表明AQP-1在调节肺内液体平衡中可能起重要作用，参与了ALI肺水肿的发病过程[14,15]。本研究结果亦表明，与正常对照组及正常电针组比较，模型组大鼠肺组织中AQP-1水平降低。

胰源性肺损伤属中医学“心下痛、胃痛”范畴，胰肝相关、肝胃不和，脾胃运化失常，痰湿内生，阳气被遏，经气与腑气运行不通畅，不通则痛而发为本病[16]。中医生理学认为，肺失肃降，则阳明经大肠经气运化失调，肺与大肠两者互为表里，胰肝脾肠统属消化系统，六腑以通为顺，不通则使肺气上逆，肃降失调，此时如采用通脏之法，清利大肠经，则有益于肃降肺气，恢复肺之宣降功能复常，肺又助于通调百脉，则诸症可解[17]。由此可知，通过治大肠腑治疗肺病思路有着充分的理论支持依据。

针灸是一种能够充分激发人体自身潜力和调动整体的调节方法，它主要通过各种物理化学方式(热刺激、机械刺激、电刺激等)刺激人体相关腧穴，从而使经络之气被激发，阴阳协调，最终达到防治疾病的目的。针灸本身具备效之信，若风之吹云的效果，取法得当，可快速宣肺通腑，发挥治疗作用。针刺作用的实验研究已然表明，针刺可充分调动机体自身内源性自限、品质、双向调节机能，维护机体自身功能平衡。天枢穴位本身属于足阳明胃经，大肠的募穴，“腑病取募”，有天然通腑治疗作用，是治疗消化系统疾病最常用的穴位，对胃肠麻痹性腹胀、腹痛具有较好的临床作用[18]，具备通腑保肺的有关作用[19,20]。本研究结果发现，电针模型组大鼠肺组织AQP-1水平较模型组升高，表明电针刺激天枢穴可上调SAP大鼠肺组织中AQP-1的表达，进而减轻ALI。本研究结果对祖国针灸医学的推广应用具有重要的临床意义。

[1] 陈秋星,吕德超,曹斌,等.重症急性胰腺炎并发急性肺损伤危险因素的临床研究[J].肝胆胰外科杂志,2012,24(6):451-454，458.

[2] 赵翠娟,陈吉,崔宏,等.重症急性胰腺炎合并肺损伤相关发病机制[J].国际消化病杂志,2014,34(5):320-322.

[3] Pastor CM, Matthay MA, Frossard JL. Pancreatitis-associated acute lung injury: new insights[J]. Chest, 2003,124(6):2341-2351.

[4] 孙燕妮,杨洁,承解静,等.脓毒症急性肺损伤大鼠肺组织AQP-1、AQP-5表达变化及意义[J].山东医药,2014,54(12):21-23.

[5] Li G, Li S, An L, et al. Electroacupuncture alleviates intraoperative immunosuppression in patients undergoing supratentorial craniotomy[J]. Acupunct Med, 2013,31(1):51-56.

[6] 黎晖,杜少辉,李伊为,等.电针内关对内毒素休克大鼠模型肺组织中一氧化氮合酶活性的影响[J].上海针灸杂志,2003,22(11):3-6.

[7] 王锋,黄鹤光,陆逢春,等.胆胰管结扎法制作大鼠胰源性肺损伤模型[J].中国普外基础与临床杂志,2012,19(1):25-30.

[8] 陈秋星,吕德超,曹斌,等.重症急性胰腺炎并发急性肺损伤危险因素的临床研究[J].肝胆胰外科杂志,2012,24(6):451-454.

[9]赵翠娟,陈吉,崔宏,等.重症急性胰腺炎合并肺损伤相关发病机制[J].国际消化病杂志,2014,34(5):320-322。

[10] Kylnp L, Rakonczay Z Jr, O′Reilly DA. The clinical course of acute pancreatitis and the inflammatory mediators that drive it[J]. Int J Inflam, 2012,2012:360685.

[11] 刘笑玎,原铭贞,王司仪,等.水通道蛋白1、3、4和5与急性肺损伤关系的研究进展[J].吉林大学学报(医学版),2014,40(5):1119-1122.

[12] 李波,陈东,王桂芳,等.水通道蛋白1、3、4、5在内毒素性急性肺损伤小鼠肺组织中的表达[J].第二军医大学学报,2008,29(2):131-135.

[13] 谢艳萍,陈才平,王建春,等.急性肺损伤大鼠肺水通道蛋白1和5的表达及功能的实验研究[J].中华结核和呼吸杂志,2005,28(6):385-389.

[14] 岳胜,朱平,岳磊,等.急性肺损伤大鼠呼吸膜AQP1和AQP5的表达[J].中国比较医学杂志,2016,26(8):70-74，90.

[15] 刘笑玎,原铭贞,王司仪,等.水通道蛋白1、3、4和5与急性肺损伤关系的研究进展[J].吉林大学学报(医学版),2014,56(5):1119-1122.

[16] 韩恩昆,吴咸中.大承气汤和活血清胰汤对重型急性胰腺炎肺损伤治疗的实验研究[J].中国中西医结合外科杂志,2004,10(2):28-30.

[17] 石占利,李国辉,孙静,等.大黄素对重症急性胰腺炎并发急性肺损伤大鼠的干预作用[J/OL].中华危重症医学杂志(电子版),2015,8(3):143-149.

[18] 王成伟,李宁,何洪波,等.电针双侧天枢穴对功能性便秘患者自觉症状的影响及疗效满意度评价:一项单中心、前瞻性随机对照临床试验[J].针刺研究，2010,35(5):375-379.

[19] 聂容荣,袁晟光,刘杰,等.山姜素对急性重症胰腺炎大鼠肺损伤中水通道蛋白-1表达的影响[J].中国老年学杂志,2015,35(18):5062-5064.

[20] 李雷兵,张琦.中医药关于水通道蛋白表达的研究进展[J].中国中医基础医学杂志,2015,21(9):1194-1195，1198.

广西高校科学技术研究项目(YB2014273)。

齐立(E-mail： 21658135@qq.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.22.012

R657.5

A

1002-266X(2017)22-0035-03

2017-01-09)