MEN-10，376对断尾小鼠ACG神经元Fos蛋白表达的影响

吴敏范，马积昊，杨宇*，商丽宏，李娜然，张雅娟，吴孟霏

（1.沈阳医学院基础医学院生理学教研室，辽宁沈阳110034；2.辽宁何氏医学院；3.形态学实验室；4.沈阳市第五人民医院神经内科）

MEN-10，376对断尾小鼠ACG神经元Fos蛋白表达的影响

吴敏范1，马积昊2，杨宇1*，商丽宏1，李娜然3，张雅娟4，吴孟霏2

（1.沈阳医学院基础医学院生理学教研室，辽宁沈阳110034；2.辽宁何氏医学院；3.形态学实验室；4.沈阳市第五人民医院神经内科）

目的：探讨静脉注射NK-2受体拮抗剂MEN-10，376对断尾小鼠扣带回前部（anterior cingulate gyrus，ACG）神经元Fos蛋白表达的影响。方法：应用免疫组化技术研究静脉注射MEN-10，376对小鼠尾末端2.5 cm剪断后30min ACG神经元Fos蛋白表达的影响。结果：与空白对照组比较，断尾小鼠ACG神经元Fos蛋白表达在断尾后30min显著增高；MEN-10，376静脉注射抑制了断尾引起的ACG神经元Fos蛋白表达的显著增高（P＜0.01）。结论：断尾小鼠ACG神经元Fos蛋白表达显著增高的过程有外周速激肽NK-2受体参与。

MEN-10，376；NK-2受体；扣带回前部；幻肢痛；Fos蛋白

研究证明扣带回前部（anterior cingulate gyrus，ACG）是痛觉的重要中枢［1-2］；由于自然灾害、交通肇事、疾病等原因进行截肢后的患者，60%以上出现幻肢痛（phantom limb pain，PLP）。目前，PLP发病的机制还不清楚［3］。研究发现截肢后大鼠的ACG对来自神经中枢的刺激和来自外周组织的刺激反应明显增强［4］；神经元Fos蛋白表达［5］、速激肽NK-2受体与痛觉有关［6-7］。本课题组研究发现，中枢速激肽NK-2受体参与小鼠断尾引起的ACG神经元的Fos蛋白表达显著增高的过程［8］。但是，外周速激肽NK-2受体是否参与该过程尚未见报道。因此，本实验对此进行了研究，并且比较了NK-2受体拮抗剂MEN-10，376对中枢NK-2受体与外周NK-2受体的作用，为治疗PLP提供了新的实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组选取昆明种成年雌性小鼠24只，体重（27±6）g，动物生产许可证号：SCXK（辽）2010-0001，由沈阳医学院实验动物中心提供。将小鼠随机分为空白对照组、断尾后30min组、MEN-10，376（NK-2受体拮抗剂）静脉注射（iv）组、生理盐水iv组，各6只。

1.2 试剂ABC试剂盒及DAB试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司），MEN-10，376（美国Sigma公司）。

1.3 断尾方法及给药方法给予小鼠1%戊巴比妥钠按照40mg/kg体重腹腔注射麻醉后，空白对照组不做任何处理；断尾后30min组使用手术剪刀将小鼠尾末端2.5 cm剪断；MEN-10，376 iv组按照1mg/kg体重给予1%MEN-10，376尾静脉注射后10min剪断小鼠尾末端2.5 cm；生理盐水iv组给予同体积生理盐水尾静脉注射后10min剪断小鼠尾末端2.5 cm，均用棉球止血。

1.4 检测ACG神经元的Fos蛋白表达断尾后30min，将上述各组小鼠迅速断头、取脑，放入温度为4℃的4%多聚甲醛溶液中过夜固定。冰冻切片机在-20℃的温度下连续冠状切片，切片的厚度为15μm。用常规的免疫组织化学方法进行染片、洗片，最后用树胶封片。用显微图像分析仪进行切片ACG神经元的Fos蛋白表达阳性细胞积分光密度及面积百分比的检测。

1.5 统计学方法采用软件SPSS 13.0对数据进行统计学分析，计量资料采用（x±s）表示，采用单因素方差分析、Dunnett-t检验进行组间比较，P＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

与空白对照组比较，断尾后30min组、生理盐水iv组ACG神经元Fos蛋白表达显著地增高（P＜0.01），即阳性细胞积分光密度和面积百分比都显著地增高；而MEN-10，376 iv组ACG神经元的Fos蛋白表达无明显增高（P＞0.05）。与断尾后30min组、生理盐水iv组相比较，MEN-10，376 iv组ACG神经元的Fos蛋白表达显著地降低（P＜0.01）。见表1、图1。

表1 尾静脉注射MEN-10，376对断尾小鼠ACG神经元的Fos蛋白表达影响

图1 尾静脉注射MEN-10，376对断尾小鼠ACG神经元的Fos蛋白表达影响（免疫组化染色×400）

3 讨论

研究表明在中枢神经系统表达Fos蛋白的部位，与伤害性信息的传入、分析整合有关［9］；截肢对大鼠ACG神经元的活动有明显的影响［4］。本课题组研究发现，剪断小鼠尾末端后30 min引起ACG神经元Fos蛋白表达显著增高。该结果表明，断尾小鼠ACG的神经元能感受伤害信息的传入，参与断尾引起的中枢神经系统可塑性改变。本实验研究结果为进一步研究PLP提供了新的科学实验依据。

PLP是截肢术后患者常见的并发症。然而，PLP的产生原因目前尚不清楚。NK-2速激肽受体参与痛觉活动［10］。中枢速激肽NK-2受体参与小鼠断尾引起的ACG神经元的Fos蛋白表达显著增高的过程［8］。但是，外周速激肽NK-2受体是否参与该过程尚未见报道。本研究观察到尾静脉注射MEN-10，376能够抑制剪断尾末端诱发的ACG神经元Fos蛋白表达水平的显著增高，提示外周NK-2受体参与了剪断尾末端诱发的ACG神经元Fos蛋白表达水平的显著增高过程，外周NK-2受体可能是治疗PLP的重要潜在靶点之一。比较对剪断尾末端诱发的ACG神经元Fos蛋白表达水平显著增高的抑制作用，MEN-10，376尾静脉注射（ACG神经元Fos蛋白表达阳性细胞积分光密度5.9724± 0.9077和面积百分比1.6976±0.4305）强于蛛网膜下腔注射（ACG神经元Fos蛋白表达阳性细胞积分光密度6.2372±0.4174和面积百分比2.1594± 0.3392）［8］，提示MEN-10，376阻断外周NK-2受体的作用强于阻断中枢NK-2受体的作用。

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Effect of MEN-10，376 on Fos Protein Expression of Neurons in Anterior Cingulate Gyrus Caused by Am putating theM ice TailExtrem ity

WUMinfan1，MA Jihao2，YANGYu1*，SHANG Lihong1，LINaran3，ZHANGYajuan4，WUMengfei2
（1.Department of Physiology，Shenyang Medical College，Shenyang 110034，China；2.He University，3.Laboratory of Morphology；4. Departmentof Neurology，The Fifth People's Hospitalof Shenyang）

Objective：To investigste the effectof intravenous injection of NK-2 receptor antagonistMEN-10，376 on Fos protein expression of neurons in anterior cingulate gyrus（ACG）caused by amputating the mice tail extremity.Method：The effect of intravenous injection ofMEN-10，376 on Fos protein expression ofneurons in ACG at30min after amputating themice tailextremity 2.5 cm was studied with immunohistochemistrymethod.Result：Compared with the control group，Fos protein expression of neurons in ACG at30min after the amputating increased remarkably，which was inhibited by intravenous injection ofMEN-10，376（P＜0.01）.Conclusion：Peripheral tachykinin NK-2 receptors are involved in the process of remarkable increase in Fos protein expression of neurons in ACG of the amputatedmice.

MEN-10，376；NK-2 receptor；anterior cingulate gyrus；phantom limb pain；Fos protein

R338；Q432

A

1008-2344（2017）03-0196-02

10.16753/j.cnki.1008-2344.2017.03.003

2017-02-11

（文敏编辑）

辽宁省科技厅基金项目（No.L2015020391）；沈阳市科技局计划项目（No.F13-220-9-45）

吴敏范（1963—），女（满），博士，教授，研究方向：痛觉及镇痛机制.

［通讯作者］杨宇（1976—），男（汉），硕士，讲师，研究方向：痛觉及镇痛机制.E-mail：129977@qq.com