鱼类肠道外源乳酸杆菌DNA提取样品前处理优化

张雯

摘 要：优化鱼类肠道外源乳酸杆菌DNA提取的方法。样本匀浆后加入PEG8000（40%）1000rpm离心10min，可以沉淀并去除影响DNA提取质量及抑制Real-timePCR反应的杂质。平板计数结果显示，对比未处理前样品，离心上清保留90%以上的菌液，同时杂质的去除大幅度地降低了样本的背景值。本研究为优化鱼类肠道外源乳酸杆菌定量分析体系提供理论依据。

关键词：DNA提取；前处理；微生物多样性定性定量

目前国内外对肠道乳酸杆菌的定量方法主要有培养法和免培养法。培养法主要采用对肠内容物样本平板计数法，是最原始的计数方法，易操作好掌握，成本低，但耗时长，且只能检测活菌数量。在多种免培养法中，Real-time PCR技术已广泛运用于各个领域的微生物定量中，一般步骤包括样本前处理、DNA提取、PCR计数，该方法最主要的优势为不仅可以计数活菌还可以计数死菌量，大量研究表明，死菌同样具有益生功效，通过特异性引物的设计可以达到绝对定量。

本研究旨在优化肠道外源添加乳酸杆菌定量方法体系，确定针对于鱼类肠道样本前处理的最佳方法，解决快速、准确定量鱼类肠道外源添加乳酸杆菌的计数方法。为以后深入研究菌群代谢提供技术依据。

一、材料与方法

1.材料

（1） 试验动物。

罗非鱼1.5～2.5g（贵州省罗甸罗非鱼养殖场），斑马鱼0.3～0.5g（贵州省都匀市观赏鱼市场）。正式试验进行前，试验动物均在适宜条件下暂养，确保其健康。

（2） 试验菌株。

菌株来源于中国农业科学院饲料研究所水产研究室保存菌株。在MRS培养基中静置37℃培养12 h。

（3） 试剂耗材。

PEG8000，MRS液体培养基，MRS固体培养基（oxide），溶菌酶粉末，溶菌酶缓冲液，5M NaCl，CTAB/NaCl，氯仿，异戊醇，tris饱和酚，乙醇，20×TE缓冲液，10%SDS，蛋白酶K，100μm、40μm细胞过滤器（Biologix，美国），DNA小提试剂盒（Qiagen，德国）。

（4） 主要仪器。

T10匀浆器（IKA，德国），TDZ5-WS 多管架台式离心机（湖南湘仪），SPX-80生化培养箱（宁波江南仪器厂），Gel Doc XR+凝胶成像仪（Bio-rad，美国）等。

2.方法

（1）样本前处理优化。

JCM1149为MRS卡纳抗性，卡纳浓度12.5ng/ml。对于方法A和方法B，选取罗非鱼12条，上午10点喂食，下午2点肠道取样。其中11条每条肠道均添加JCM1149菌液1ml。1条罗非鱼肠道直接匀浆稀释涂板。菌液稀释涂板计数。

方法A：震荡静止取上清法对比常规匀浆处理。4条剪开肠道较为强烈的震荡（1200rpm/min），静止，取上清，4条为全肠匀浆，处理后五个重复梯度稀释涂板（卡纳抗性MRS板），剩余样本12000rpm，5min离心，留沉淀于-80℃，用于DNA提取。

方法B：3条匀浆后再加入MRS1ml，100um滤网过滤，滤液经过40um滤网再次过滤，留滤液2ml梯度稀释涂板。涂板后，12000rpm，5min离心，沉淀于-80℃。

方法C：在10ml，20%，40%PEG8000中分别加入2ml菌液，1000rpm离心10min，20min后取上清2ml，上清下1ml，剩余9ml混匀后稀释涂板，梯度稀释，3个重复。计数经过不同浓度的PE8000，不同离心时间前处理后的菌落数，比对未经处理JCM1149纯菌数，计算此方法的回收率。

方法D：將JCM1149菌液，加入9ml灭菌后的MRS中，终体积10ml；取2条罗非鱼肠道，于上一步10ml含JCM1149菌液的PBS中，充分匀浆，混匀。取4个15ml细胞离心管分别加入10ml40%PEG8000，于上层分别缓慢加入2ml匀浆后样本，分别以不同转速（1000rpm，1500rpm），不同时间（10min，20min）离心；取离心后上清，上清下1ml，剩余液体9ml混匀分别梯度稀释，3个重复，涂板计数；JCM1149原液梯度稀释涂板计数。涂板稀释后剩余样本均12000rpm，5min离心，留沉淀于-80℃，用于DNA提取。

二、结果与分析

1.样本前处理优化结果

不同方法前处理罗非鱼肠道，比较回收率，可见震荡静止取上清方法获取的目的菌约为原始匀浆方法的50%，而100μm，40μm滤网过滤只占添加菌液的15.64%（表1）。当PEG80000浓度是40%，且离心时间为1000rpm，10min时JCM1149菌液回收率最高，高达91.04%（表2），进一步摸索对于罗非鱼肠道PEG8000前处理的最佳离心转速和时间，结果当PEG80000浓度是40%，且离心时间为1000rpm，10min时回收率最高（表3），这与之前试验结果相符，且PEG8000处理，可沉淀大量杂质（图1）。因此，后面试验均使用40%PEG8000，1000rpm，10min离心作为DNA提取前处理样品。

三、讨论

罗非鱼属于杂食性，肠道菌群多样化（Saravanan and Geurden et al. 2012），匀浆方式前处理肠道样本回收率最高，且大于100%，分析是复杂的肠道菌群结构，含有部分适应该浓度卡纳抗性的菌群所致。而震荡取上清方法，对于沉淀的时间较难把握，过短则不能沉淀大量杂质，过长则使大量细菌沉淀，降低回收率。过滤法，二次过滤，滤网孔径较小，由于杂质的存在，容易堵塞滤孔，所需时间冗长，更换滤网造成更大损失，但扩大滤网孔径，则不能很好的除去杂质。

PEG（polyethylene glycol，聚乙二醇）是一种高分子渗压剂，用于对样本的沉淀，分离纯化作用，可用来沉淀蛋白质等（Matsuda and Waldo et al. 1988）。有研究用PEG处理对云南松种子，研究其对种族发芽及生理生化特性的影响。结果表明， PEG处理种子发芽率、可溶性糖、可溶性蛋白含量均有显著变化（王晓丽与曹子林等， 2012）。不同分子量的PEG聚乙二醇，分子量的大小会影响PEG在粒子上的吸附牢固程度及粒子的相互作用，PEG链长过短，粒子易脱落，过长则使粒子不易脱落（施一鸣与单国荣， 2013）。聚乙二醇沉淀（PEG8000）可以沉淀小球藻病毒FJ-1，最佳使用量为 PEG8000 7%和4%氯化钠，但PEG8000的沉淀效率低于超速离心法（Han and Kang et al. 2000）。免疫学上，对于循环免疫复合物的沉淀，PEG也有好的结果（Herreman and Godeau et al. 1978）。研究疾病时，从血浆中获得的沉淀物用PEG重悬纯化，得到的在PEG中的沉淀物再次重悬，进行后续研究，有很好的纯化作用（Ristol and Gensana et al. 1996）。20%PEG8000浓度过低，不足以阻止含所需样本的MRS层停留在上清，导致目的菌沉入上清以下的部分。

对比纯菌涂板结果，40%PEG8000处理后回收率最高，可以初步确定PEG8000用于样本前处理的可行性，但随着离心转速和离心时间的增长，回收率显著降低，表明离心转速与回收率高低密切相关。为了进一步确定合适的离心时间和离心转速，因此降低增大的离心转速，由2000rpm改为1500rpm，再次验证，结果仍然为1000rpm，10min回收率最高，且1500rpm，20min回收率显著降低。MRS上清于PEG8000分界线不显著，出现弥散现象，结果证明随着离心转速增大和离心时间的增长，使大量目的菌离开含MRS上清，向PEG8000层移动，导致回收率降低。

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