儿童过敏性鼻炎和支气管哮喘中周围Th17和调节性T细胞的失衡

吴亲芳, 陈 宇, 王志纲, 苏 雯, 许春娣

(1. 上海市瑞金医院 儿科, 上海, 200000; 2. 上海市江湾医院 儿科, 上海, 200000;3. 上海市控江医院 儿科, 上海, 200000)



儿童过敏性鼻炎和支气管哮喘中周围Th17和调节性T细胞的失衡

吴亲芳1,3, 陈 宇2, 王志纲2, 苏 雯1, 许春娣1

(1. 上海市瑞金医院 儿科, 上海, 200000; 2. 上海市江湾医院 儿科, 上海, 200000;3. 上海市控江医院 儿科, 上海, 200000)

目的 探讨周围Th17细胞(Th17)和调节性T细胞(Treg)在儿童过敏性鼻炎(AR)与支气管哮喘(BA)中的失衡及临床意义。方法 选取单纯过敏性鼻炎(AR组)、单纯支气管哮喘(BA组)及过敏性鼻炎合并支气管哮喘儿童(AR+BA组)为研究对象，每组25例。以同期入院体检的25例健康儿童为对照组。比较4组外周血Th17细胞、Treg细胞水平，对比4组免疫球蛋白E(IgE)、转化生长因子β1(TGF-β1)、第1秒用力呼气容积占预计值百分比(FEV1%)及血清白介素IL-6、IL-17、IL-23、IL-10水平，并分析AR合并BA患儿IgE、FEV1%与Th17、Treg、TGF-β1、IL-17的相关性。结果 AR组、BA组、AR+BA组外周血Th17细胞、Treg细胞、IgE、TGF-β1、FEV1%与对照组比较均有显著差异(P<0.05); AR组、BA组、AR+BA组IL-6、IL-17、IL-23均显著高于对照组(P<0.05), 且AR+BA组IL-17显著高于AR组、BA组(P<0.05); 相关分析显示IgE与Th17、IL-17水平呈正相关，与Treg、TGF-β1水平呈负相关(P<0.05)。结论 儿童过敏性鼻炎和支气管哮喘中Th17与Treg细胞存在失衡，且其表达与IgE、FEV1%均存在一定相关性。

儿童; 过敏性鼻炎; 支气管哮喘; Th17; Treg; 失衡

过敏性疾病包括过敏性鼻炎(AR)和支气管哮喘(BA)等慢性炎症性疾病，是抗原异常免疫反应，其中BA是儿童较常见的慢性呼吸道疾病，该病可导致气道慢性炎症反应、气道痉挛及气道反应性增加，从而出现反复喘息、咳嗽、气促及胸闷症状。研究[1-2]表明BA不仅发病率在增加，其中部分BA患者伴随AR, AR可继发BA而使BA病情难以控制和管理，严重影响患儿健康及生长发育。AR与BA的发病机制均属于IgE介导的Ⅰ型变态反应，主要是局部免疫应答，共同特征为气道高反应性。研究[3-4]显示BA患儿外周血中T细胞亚群含量紊乱与气道重塑及炎性细胞浸润程度有关，其中Th17及IL-17过量表达可引起调节性T细胞功能缺陷或Treg细胞数量降低，促进过敏性疾病发展，而Th17及Treg细胞失衡在AR合并BA的意义在临床研究较少。本文选取本院收治的单纯AR、单纯BA、AR合并BA儿童及健康体检儿童各25例为研究对象，分析AR合并BA患儿外周血Th17、Treg的失衡及其临床意义，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2014年7月—2017年2月本院收治的单纯过敏性鼻炎(AR组)、单纯支气管哮喘(BA组)及过敏性鼻炎合并支气管哮喘儿童(AR+BA组)为研究对象，每组25例。AR患儿符合《儿童变应性鼻炎诊断和治疗的专家共识(2010年，重庆)》[5]中AR诊断标准: ① 出现清水样鼻涕、鼻痒、鼻塞、喷嚏等症状2项及以上，每天症状持续或累计约1 h以上，伴眼痒、结膜充血等眼部症状，症状严重患儿可见手掌或手指向上揉鼻; ②皮肤点刺试验及血清特异性IgE检测试验中任何一项为阳性。BA患儿符合《儿童支气管哮喘诊断与防治指南(2016年版)》[6]中BA诊断标准: ① 反复喘息、咳嗽、气促、胸闷，发作时双肺可闻及散在或弥漫性以呼气相为主的哮鸣音，呼气相延长; ② 症状不典型，但具备支气管舒张试验阳性、抗感染治疗后肺通气功能改善、支气管激发试验阳性、最大呼气峰流量日间变异率≥13%中至少一项。AR合并BA诊断标准参照上述诊断标准。排除标准: ① 心、肝、肾等严重疾病患儿或非首发患儿; ② 入组前1周接受过糖皮质激素及支气管舒张类药物患儿; ③ 家属及其监护人不同意本研究或不配合医师进行相关检查者。另以同期入院体检的健康儿童25例为对照组，排除合并严重心肝肾等重要脏器功能不全者。AR组中男13例，女12例; 年龄6～10岁，平均 (8.10±0.43)岁; BA组中男12例，女13例; 年龄5～11岁，平均(8.11±0.41)岁; AR+BA组中男12例，女13例; 年龄7～10岁，平均(8.09±0.44)岁; 对照组中男14例，女11例; 年龄6～11岁，平均(8.12±0.41)岁, 4组一般资料比较无显著差异(P>0.05), 具有可比性。本研究经本院医学伦理委员会批准通过，且患儿家属知情同意本研究并签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 标本采集：采用5 mL肝素钠抗凝负压真空采血管采集患儿晨空腹静脉血4 mL, 在4h内进行标本处理，取300 μL全血做流式细胞分析，剩余全血300 G/min离心10 min后，将上层血浆用于检测血浆细胞因子水平，沉淀部分用于分离PBMC, 标本置于-80 ℃保存。

1.2.2 检测方法: ① 流式细胞技术检测外周血CD4+Th17+细胞、CD4+Foxp3+细胞：采用Ficoll密度梯度离心法分离PBMC, 以PBC洗2次后，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基重悬，以台盼蓝染色并检测活性，在24孔板中培养，细胞计数2×109/L，每孔培养基中加入至浓度PMA为50 μg/L，离子霉素为750 μg/L, 高尔基体阻断剂莫能星2.0 μmol/L, 混匀后在37 ℃、50 mL/L CO2培养箱中培养4 h, 将细胞悬液转移至1.5 mL EP管中，以 2 000 r/min离心8 min, 弃去上清液，用PBS洗2次，取流式细胞仪专用试管，分别标记抗体管、同型对照管，在各管中加入经刺激的PBMC后分别加入10 ψ CD4-FITC，低速混匀后于室温避光15～20 min，加固定/破膜稀释液，低速涡旋混匀后4℃避光30 min，在抗体管中加入10 ψ免疫荧光Foxp3-PE单克隆抗体，在对照组管中加入IgG抗体，低速涡旋混匀后4 ℃避光30 min, 应用流式细胞仪(美国Beckman公司, Epics-XL)测定CD4+Th17细胞比例及CD4+Foxp3细胞比例，检测结果用EXPRO32 ADC软件进行分析。② 应用肺功能检测仪测定FEV1%, 正常值为83%。③ 应用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定血浆IgE、TGF-β1、IL-6、IL-17、IL-23、IL-10水平，采用美国TSZ公司原装进口试剂，上海MK3型酶标仪, 450 nm波长，测定OD值，设定空白对照，线性折线拟合格标准曲线。

1.3 观察指标

① 比较4组外周血Th17细胞(以CD4+Th17细胞表示)、Treg细胞(以CD4+Foxp3表示)水平; ② 分析4组IgE、TGF-β1、FEV1%水平，FEV1%正常值≥83%; ③ 测定4组血IL-6、IL-17、IL-23、IL-10水平; ④ 分析AR合并BA患儿IgE、FEV1%与Th17、Treg、TGF-β1、IL-17的相关性,r>0.95为显著性相关,r≥0.8为高度相关,r≥0.5～<0.8为中度相关,r≥0.3～<0.5为低度相关,r<0.3为不相关。

2 结 果

2.1 4组患儿外周血Th17、Treg细胞水平比较

AR组、BA组、AR+BA组外周血Th17细胞均显著高于对照组(P<0.05), AR组、BA组、AR+BA组Treg细胞均显著低于对照组(P<0.05), 且AR+BA组外周血Th17细胞较AR组、BA组高(P<0.05), AR+BA组Treg细胞低于AR组、BA组(P<0.05), AR组、BA组上述指标比较无显著差异(P>0.05)。见表1。

表1 4组患儿外周血Th17、Treg细胞水平比较 %

与对照组比较, *P<0.05; 与AR+BA组比较, #P<0.05。

2.2 4组患儿血IgE、TGF-β1及FEV1%水平比较

AR组、BA组、AR+BA组外周血IgE显著高于对照组, AR组、BA组、AR+BA组 TGF-β1、FEV1%较对照组低，且AR+BA组IgE较AR组、BA组高, TGF-β1、FEV1%较AR组、BA组低，差异有统计学意义(P<0.05), AR组、BA组上述指标比较无显著差异(P>0.05)。见表2。

表2 4组患儿血IgE、TGF-β1及FEV1%水平比较

与对照组比较, *P<0.05; 与AR+BA组比较, #P<0.05。

2.3 4组患儿血浆细胞因子水平比较

AR组、BA组、AR+BA组血浆IL-6、IL-17、IL-23均显著高于对照组(P<0.05), IL-10无显著差异(P>0.05), 且AR+BA组IL-17较AR组、BA组高(P<0.05), AR组、BA组上述指标比较无显著差异(P>0.05)。见表3。

表3 4组患儿血浆细胞因子水平比较 pg/mL

与对照组比较, *P<0.05; 与AR+BA组比较, #P<0.05。

2.4 AR+BA患儿血IgE、FEV1%与Th17、Treg、TGF-β1、IL-17的相关性分析

相关分析显示IgE与Th17、IL-17水平呈正相关(r=0.705、0.777,P<0.01), 与Treg、TGF-β1水平呈负相关(r=-0.629、-0.224,P<0.01), FEV1%则与Th17、IL-17水平呈负相关 (r=-0.801、-0.764,P<0.01), 与Treg、TGF-β1水平呈正相关(r=0.721、0.811,P<0.01)。见表4。

表4 AR+BA患儿血IgE、FEV1%与Th17、Treg、TGF-β1、IL-17的相关性分析

3 讨 论

儿童支气管哮喘(BA)以气流受限、气道重塑为主要特征，是由中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、T淋巴细胞等多种炎性细胞及黏附分子、细胞因子共同参与的气道慢性炎症性疾病，而过敏性鼻炎(AR)又称为变应性鼻炎，儿童BA与AR除病变部位及临床表现不同外，两者病因学、发病机制及黏膜慢性炎症病理改变极为相似，很多患儿同时或先后并存AR、BA两种疾病, AR可加重BA症状，使哮喘治疗更加困难，因此分析AR合并BA患儿的发病机制对疾病诊断及治疗有重要意义[7-9]。AR、BA发病机制均属于IgE介导的Ⅰ型变态反应，病理改变在于机体受到变应原刺激后多种免疫活性细胞参与疾病过程，当发生Ⅰ型变态反应时, IgE发挥其与肥大细胞、嗜酸性粒细胞结合的免疫功能，直接从免疫根源阻断过敏生物链，直击免疫T细胞，增强免疫T细胞调控能力，因此外周血中检测到IgE水平升高时提示过敏性疾病可能[10-12]。在AR及BA发病时，患儿肺功能明显受损，应用肺功能检测仪检测时可见其FEV1%下降，同时有研究显示动态检测TGF-β1水平对支气管哮喘早期诊断及治疗监测有较广阔应用前景, TGF-β1具有促进间质细胞增殖、促细胞转化与分化、促进血管生成及促细胞外基质合成等多种生物学功能，在肺纤维化变性中，其激活被认为是病程进展的标志点[13-14]。实验和临床数据表明Th1和Th2细胞平衡反应是过敏性气道炎症发病机制，近年来人们认识到Th1/Th2失衡并不能完全解释哮喘病因，而Th17和调节性T细胞(Treg)作为Th1和Th2 细胞的两个不同亚群最近在T细胞群研究中逐渐深入, Th17及其效应性细胞因子IL-17在自身免疫性疾病和慢性炎症发展中有促炎作用, Th17细胞分泌的IL-6、IL-17、IL-23、IL-10等细胞因子在集体动员、募集、活化中性粒细胞等方面起重要作用，而Treg在抑制炎症及维持机体免疫稳态方面发挥重要作用，与哮喘呼吸道炎症密切相关，目前多项研究[15-17]表明Th17/Treg细胞的失衡在支气管哮喘发病中发挥重要作用，可影响支气管哮喘患者气道炎性反应，而AR合并BA发病中是否存在Th17/Treg细胞失衡在临床报道尚少。

夏治等[18]分析了支气管哮喘患儿外周血Th17和CD4+CD25+调节性T细胞变化及其活动状态相关性，结果显示观察组患儿外周血Th17、CD4+CD25+Treg细胞较健康对照组明显提高，且随病情程度加重，患儿外周血Th17呈上升趋势，而CD4+CD25+Treg细胞随病情加重而降低，本研究结果显示AR组、BA组、AR+BA组外周血Th17细胞均高于对照组, AR组、BA组、AR+BA组Treg细胞均低于对照组，这与上述研究结果相似。本研究中AR+BA组外周血Th17细胞较AR组、BA组高, Treg细胞于AR组、BA组，证实AR合并BA患儿存在Th17、Treg细胞的失衡, Th17、Treg细胞可能参与疾病进展，可作为治疗新靶点。在 TGF-β1及细胞因子水平方面，田戈等[19]分析了支气管哮喘患者外周血TH1、TH2、TH17及Treg细胞相关细胞因子的表达及意义，结果显示与健康对照组相比，哮喘患者血清中TGF-β1、IL-1、I6、IL-17A呈明显增高趋势，而IL-10比较无显著差异，推测与Th1、Th2、Th17及Treg细胞的失衡有关。本研究结果显示, AR组、BA组、AR+BA组TGF-β1低于对照组, IL-6、IL-17、IL-23均较对照组高，这与上述研究结果相似，且AR+BA组TGF-β1与AR组、BA组比较显著低, IL-17与AR组、BA组比较明显较高。本研究结果亦显示, AR+BA组IgE高于AR组、BA组, FEV1%低于AR组、BA组，因此AR合并BA患儿外周血IgE、TGF-β1及FEV1%、IL-6、IL-17、IL-23水平与单纯AR或BA存在显著差异，推测可能与Th17、Treg细胞的失衡有关。在IgE、FEV1%与Th17、Treg细胞水平相关性方面。研究[20]显示，过敏性气道疾病患儿中，其总IgE水平与Th17、血浆IL-17水平呈正相关，与Treg细胞、TGF-β1水平呈负相关，而FEV1%与Th17细胞、血浆IL-17水平呈负相关，与Treg细胞、TGF-β1水平呈正相关，本研究结果显示对于AR合并BA患儿，其IgE与Th17、IL-17水平呈正相关，与Treg、TGF-β1水平呈负相关; 而FEV1%则与Th17、IL-17水平呈负相关，与Treg、TGF-β1水平呈负相关，这与上述报道结果相似，证实在AR合并BA患儿中存在Th17细胞、Treg细胞的失衡，其水平与AR或BA有关的检测指标IgE及FEV1%存在一定相关性。

[1] 陈燕燕, 陈玉赞. 伴过敏性鼻炎的鼾症病患儿手术联合舌下含服免疫治疗疗效观察[J]. 贵州医药, 2016, 40(7): 726-727.

[2] 易兴亮. 中西医结合与传统西药治疗支气管哮喘合并过敏性鼻炎的临床研究[J]. 西部医学, 2015, 27(1): 47-49.

[3] 谢中勇, 陈伟明, 张伟忠, 等. 支气管哮喘患儿血清中酶类多肽、趋化因子水平及外周血免疫细胞含量的评估[J]. 海南医学院学报, 2015, 21(8): 1103-1105.

[4] 袁颖志, 贺宇彤, 吴成, 等. Th1/Th2/Th17/Treg对鉴别儿童支气管哮喘与单纯性肺炎的意义[J]. 河北医药, 2016, 38(9): 1285-1288.

[5] 《中华耳鼻咽喉头颈外科杂志》编辑委员会鼻科组, 中华医学会耳鼻咽喉头颈外科学分会鼻科学组、小儿学组, 《中华儿科杂志》编辑委员会等. 儿童变应性鼻炎诊断和治疗的专家共识(2010年, 重庆)[J]. 中华儿科杂志, 2011, 49(2): 116-117.

[6] 中华医学会儿科学分会呼吸学组, 《中华儿科杂志》编辑委员会. 儿童支气管哮喘诊断与防治指南(2016年版)[J]. 中华儿科杂志, 2016, 54(3): 167-181.

[7] 张小朴, 史锁芳. 中医药治疗过敏性鼻炎-哮喘综合征研究概况[J]. 中国中医急症, 2015, 24(1): 114-116.

[8] 杨图宏, 吕梅, 石小毛, 等. 鼻负压置换术在儿童支气管哮喘合并变应性鼻炎中的应用[J]. 医学临床研究, 2015, 32(2): 263-265.

[9] 彭向东, 何晟. 支气管哮喘合并过敏性鼻炎的中西医结合治疗[J]. 临床和实验医学杂志, 2013, 12(14): 1118-1119.

[10] 徐文中, 刘春艳. 过敏性鼻炎患儿淋巴细胞亚群、血清IgE水平的变化及其相关性[J]. 中国免疫学杂志, 2016, 32(4): 550-552.

[11] 李建木, 李琼林. 支气管哮喘患儿血清免疫球蛋白E及T淋巴细胞亚群的动态变化[J]. 海南医学院学报, 2015, 21(03): 313-315.

[12] 王侠. 支气管哮喘患儿血清免疫球蛋白E及T淋巴细胞亚群的动态变化分析[J]. 实用临床医药杂志, 2016, 20(19): 195-196.

[13] 黄勇, 郑青. 支气管肺发育不良患儿血浆及支气管肺泡灌洗液中TGF -β1和 KL -6水平变化的意义[J]. 广东医学, 2014, 35(12): 1867-1871.

[14] 郑琬丽, 陈文芬, 林振浪. 支气管肺发育不良患儿肺泡灌洗液TGF-β1和IL-8水平变化及临床意义[J]. 中国卫生检验杂志, 2016, 26(17): 2497-2500.

[15] 魏秀娟, 宗艳杰, 宋丽琴, 等. 血清IL-17与IL-23在支气管哮喘患者中的表达水平及其相关性[J]. 现代生物医学进展, 2016, 16(26): 5138-5140.

[16] 施天昀, 揭志军. Th17/Treg失衡在呼吸道合胞病毒致支气管哮喘发病机制中的作用[J]. 国际呼吸杂志, 2015, 35(15): 1167-1170.

[17] 张晴菊, 龚芳, 申卫红, 等. 儿童支气管哮喘患者外周血Th17百分数及FOXP3水平的变化及意义[J]. 国际检验医学杂志, 2014, 35(18): 2451-2452.

[18] 夏治, 汤文, 黄成娇, 等. 支气管哮喘患儿外周血Th17和CD4～+CD25～+调节性T细胞变化及其活动状态相关性分析[J]. 贵州医药, 2016, 40(9): 024-926.

[19] 田戈, 姜敏, 伊合帕尔·吐依洪, 等. 支气管哮喘患者外周血TH1、TH2、TH17及Treg细胞相关细胞因子的表达及意义[J]. 临床检验杂志, 2016, 34(10): 780-781.

[20] B Tao, G Ruan, D Wang, et al. Imbalance of Peripheral Th17 and Regulatory T Cells in Children with Allergic Rhinitis and Bronchial Asthma[J]. Iranian Journal of Allergy Asthma & Immunology, 2015, 14(3): 273-276.

Imbalance between peripheral Th17 and regulatory T cells in children with allergic rhinitis and bronchial asthma

WU Qinfang1,3, CHEN Yu2, WANG Zhigang2, SU Wen1, XU Chundi1

(1.DepartmentofPediatrics,ShanghaiRuijinHospital,Shanghai, 200000; 2.DepartmentofPediatrics,ShanghaiJiangwanHospital,Shanghai, 200000; 3.DepartmentofPediatrics,ShanghaiKongjiangHospital,Shanghai, 200000)

Objective To investigate the imbalance of peripheral Th17 cells (Th17) and regulatory T cells (Treg) in children with allergic rhinitis (AR) and bronchial asthma (BA) and its clinical significance. Methods A total of 25 children with simple AR (AR group), 25 children with simple BA (BA group) and 25 children with AR complicated with BA (AR+BA group) were selected. Another 25 healthy children were selected as control group at the same time. The levels of Th17 cells and Treg cells in peripheral blood, immunoglobulin E (IgE), transforming growth factor β1(TGF-β1), percentage of forced expiratory volume in one second in predicted value (FEV1%) and levels of serum IL-6, IL-17, IL-23 and IL-10 were compared among four groups. The correlations between IgE, FEV1% and Th17, Treg, TGF-β1, IL-17 in children with AR complicated with BA were analyzed. Results There were significant differences in peripheral blood Th17 cells, Treg cells, IgE, TGF-β1and FEV1% between AR group, BA group, AR+BA group and the control group (P<0.05). IL-17 level was significantly higher in AR+BA group than AR group and BA group (P<0.05). Correlation analysis showed that IgE was positively correlated with levels of Th17 and IL-17, and negatively correlated with Treg and TGF-β1(P<0.05). Conclusion There is imbalance of Th17 and Treg cells in children with AR and BA. Their expression are correlated with IgE and FEV1%.

children; allergic rhinitis; bronchial asthma; Th17; Treg; imbalance

2017-03-20

上海市自然科学基金项目(12ZR1425700 )

许春娣

R 765.21

A

1672-2353(2017)13-088-04

10.7619/jcmp.201713023