RNA干扰核糖核苷酸还原酶M2对耐药卵巢癌细胞凋亡及侵袭性的影响

刘 青, 牛 茹, 井松梅

(江苏省徐州市中心医院, 1. 妇科; 2．肛肠科; 3. 骨科, 江苏 徐州, 221009)



RNA干扰核糖核苷酸还原酶M2对耐药卵巢癌细胞凋亡及侵袭性的影响

刘 青1, 牛 茹2, 井松梅3

(江苏省徐州市中心医院, 1. 妇科; 2．肛肠科; 3. 骨科, 江苏 徐州, 221009)

目的 探讨RNA干扰核糖核苷酸还原酶M2(RRM2)对耐药卵巢癌细胞凋亡及侵袭性的影响。方法 将RRM2基因的特异性小干扰(siRNA)转染SKOV3/DDP设为干扰组, SKOV3/DDP细胞、SKOV3/DDP-RRM2非特异性阴性细胞设为空白组、阴性组。检测细胞增殖抑制率，计算RI、耐药转染率，荧光PCR技术检测RRM2基因mRNA表达，并分析siRNA转染对SKOV3/DDP耐药指数、RRM2蛋白的影响，采用Transwell观察SKOV3/DDP细胞侵袭能力。结果 空白组、阴性组及干扰组转染率均>90%。DDP对SKOV3/DDP细胞属低度耐药，吉西他滨对SKOV3/DDP细胞仍较为敏感。DDP、吉西他滨对干扰组、阴性组、空白组的DDP对细胞的半数抑制浓度(IC50)值比较，差异有统计学意义(P<0.05), DDP、吉西他滨对干扰组细胞的IC50值显著低于阴性组、空白组(P<0.05)。SKOV3/DDP细胞、SKOV3细胞RRM2蛋白的相对表达量比较，差异有统计学意义(P<0.05)，且转染Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组相对表达量均显著低于阴性组、空白组，其中以转染Ⅰ组细胞的RRM2蛋白相对表达量下降最显著(P<0.05)。干扰组细胞凋亡率显著高于空白组、阴性组，穿膜细胞数显著低于空白组、阴性组(P<0.05)。结论 siRNA可有效抑制RRM2基因在卵巢癌中的增殖与侵袭性，增加耐药细胞的药物敏感性，尤其是促进DDP诱导的耐药细胞凋亡。

siRNA; 核糖核苷酸还原酶M2; 卵巢癌; 耐药; 细胞凋亡

卵巢上皮性癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，其致死率在妇科肿瘤中居首位，发病率仅次于子宫颈癌和子宫体癌，近年来其临床发病呈低龄化趋势，卵巢癌患者的5年存活率较低，而及早诊断与治疗对改善患者生存质量及延长生存期至关重要[1-2]。在临床实际中，由于卵巢癌患者早期无典型症状，确诊时多数已至晚期，手术、放化疗虽可取得一定的疗效，但目前手术切除率仍较低，放化疗毒副作用大，卵巢癌的生存率不容乐观(5年仅为30%左右)[3-5]。目前卵巢癌的治疗仍以减瘤术联合铂类为主的化疗综合方案，但患者经初次治疗后有60%以上的患者可复发。目前化学药物抗肿瘤治疗作用机制主要为诱导肿瘤细胞凋亡[6]。卵巢癌细胞对放、化疗的效果主要受其发生细胞死亡的倾向的影响，故认为卵巢癌治疗失败的主要原因为癌细胞对药物所致凋亡的抵抗性和获得性耐药。核糖核苷酸还原酶M2(RRM2)基因在众多恶性肿瘤中过表达，作为细胞凋亡的主要调控基因之一，其活性高低与恶性肿瘤的生长和浸润能力呈正相关，与肿瘤耐药的形成亦有密切关系[7]。本研究探讨通过RNA干扰(RNAi)RRM2对耐药卵巢癌细胞凋亡及侵袭性的影响，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

卵巢癌细胞株SKOV3产自北京北纳生物科技有限公司，耐顺铂的卵巢癌细胞SKOV3/DDP采用间歇浓度梯度递增法经过9个月诱导成功，呈低度耐药细胞(耐药系数3.6); DMEM-F12细胞培养液、胰蛋白酶、阳离子脂质体Lipofectamine TM2000均购自上海北诺生物科技有限公司; MTT购自美国PMSF: Serva公司，鼠抗人RRM2单克隆抗体购自美国novus公司; 顺怕(DDP)购自山东齐鲁制药有限公司，磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)单克隆抗体、辣根过氧化酶标记的山羊抗鼠多克隆抗体购自上海博耀生物科技有限公司。

1.2 研究方法

1.2.1 建立耐药细胞系SKOV3/DDP: 采用含10%小牛血清的DMEM-F12培养基中培养SKOV3细胞，置于环境适宜的(37 ℃、5% CO2)孵箱中培养，观察细胞生长情况。以间歇梯度递增诱导法在6孔板中接种SKOV3细胞，培养24 h后于6孔板中加入不同终浓度DDP，培养基中继续培养，起始浓度选取能杀死50%细胞的细胞半数抑制浓度(IC50), 即0.5 μg/mL; 细胞稳定生长进入指数期后进行胰蛋白酶等传代2次，然后同一剂量药物重复培养; 稳定后在0.8 μg/mL DDP药物浓度的培养液中继续培养; 递增药物浓度后再培养，共培养9个月。

1.2.2 MTT法检测：上述培养于脱药培养2个月后以MTT法检测耐药细胞在传代、冻存后耐药指数(RI)不变的情况下进行实验。SKOV3/DDP细胞的RI取对数生长期SKOV3细胞、SKOV3/DDP细胞分别配制单细胞悬液，并以1×104个/孔接种于96孔板中(终体积200 μL/孔); 于培养24 h后加入不同终质量浓度的DDP与吉西他滨，设置5个复孔，孔板中加相同终体积的培养液; DDP与吉西他滨作用48 h后，每孔加入新配置的MTT溶液(5 mg/mL), 继续培养4 h后去掉上清液; 继续每孔加入DMSO(150 μL)后避光低速振荡至结晶物溶解; 通过酶联免疫检测法测定各孔的吸光度(波长取570 mm)。细胞增殖抑制率(%)=[1-(实验组孔吸光度-调零孔吸光度)/(空白对照孔吸光度-调零孔吸光度)]×100%。选用统计学软件SPSS 19.0分析并计算DDP对细胞的半数抑制浓度(IC50), 并计算RI(RI<5时为低耐药), RI=IC50(SKOV3/DDP)/IC50(SKOV3)。

1.2.3 脂质体介导小干扰RNA(siRNA)转染：根据RRM2基因序列和siRNA设计原则，设计RRM2基因的siRNA序列与非特异性阴性siRNA对照序列，见表1。转染前24 h SKOV3/DDP细胞取对数生长期细胞以6×105个/孔接种于6孔板，待其生长至60%后以siRNA转染，操作严格按照脂质体试剂说明书进行。

表1 RRM2基因的siRNA序列设计及非特异性阴性siRNA对照序列设计

1.2.4 检测RRM2基因mRNA表达：于转染后不同时期(24、48、72、96 h)分别提取对数生长期空白组(SKOV3/DDP细胞)、阴性组(SKOV3/DDP-RRM2非特异性阴性细胞)及干扰组(SKOV3/DDP-RRM2-RNAi细胞)的总RNA, 采用荧光PCR技术检测RRM2基因mRNA表达，以验证siRNA的干扰效果，引物序列见表2。PCR反应条件下40个循环，采集荧光信号80 ℃ 30 s, 以△△Ct法[6]重复3次计算RRM2mRNA表达水平，取平均值。

表2 引物序列及扩增基因片断

1.2.5 卵巢癌细胞凋亡：对数生长期细胞按5×104个/孔接种于6孔板，于转染siRNA 24 h后加入DDP+吉西他滨(浓度10 μg/mL), 采用细胞凋亡检测试剂盒和流式细胞仪于联合作用24、48、72、96 h后行细胞凋亡检测。

1.2.6 Transwell观察SKOV3细胞侵袭能力：于Transwell小室中孔径为8 μm的聚碳酸酯微孔膜上模拟人工基底膜，转染后6 h消化、离心重悬细胞，将细胞悬液接种含趋化因子与培养液的6孔板，然后在Transwell小室37 ℃、5%CO2环境下孵育24 h, 显微镜下观察穿膜情况。

2 结 果

2.1 siRNA转染对SKOV3/DDP耐药指数的影响

RRM2siRNA转染SKOV3/DDP细胞后4～6 h,空白组、阴性组及干扰组转染率均>90%。靶向RRM2基因的RNAi使耐药细胞对DDP的敏感度上调, MTT检测结果显示, DDP对SKOV3/DDP细胞的耐药系数为3.6，属低度耐药，吉西他滨对SKOV3/DDP细胞PI为1, 仍较为敏感。DDP、吉西他滨对干扰组、阴性组、空白组的IC50值比较，差异有统计学意义(P<0.05), DDP、吉西他滨对干扰组细胞的IC50值显著低于阴性组、空白组(P<0.05)。见表3。

表3 DDP、吉西他滨对SKOV3/DDP细胞增殖抑制率的影响 μg/mL

与空白组比较, *P<0.05; 与阴性组比较, #P<0.05。

2.2 siRNA转染对RRM2蛋白的影响

SKOV3/DDP细胞RRM2蛋白的相对表达量为(0.89±0.05), SKOV3细胞RRM2蛋白的相对表达量为(0.39±0.01), 差异有统计学意义(F=4.12,P<0.05)。转染Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ 组相对表达量依次为(0.07±0.01)、(0.30±0.01)、(0.13±0.01), 均显著低于阴性组、空白组相对表达量(0.72±0.03)、(0.56±0.04)，其中以转染Ⅰ组细胞的RRM2蛋白相对表达量下降最显著(F=8.08,P<0.05)。

2.3 siRNA转染对SKOV3/DDP细胞凋亡及侵袭性的影响

干扰组细胞凋亡率显著高于空白组、阴性组，穿膜细胞数显著低于空白组、阴性组(P<0.05), 空白组、阴性组细胞凋亡及侵袭性比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表4 siRNA转染对SKOV3/DDP细胞凋亡及侵袭性的影响

与空白组比较, *P<0.05; 与阴性组比较, #P<0.05。

3 讨 论

多数用于卵巢癌的化疗药物初用时较为敏感，但随后卵巢癌细胞可能通过改变控制凋亡级联的分子机制而产生耐药，甚至增加治疗后复发转移风险[8]。对卵巢癌患者而言，癌细胞耐药是影响临床化疗效果不满意、复发或转移及死亡率居高不下的重要因素，而提高化疗敏感性对促进肿瘤细胞凋亡至关重要[9]。早期有研究[10]指出，调控凋亡信号转导途径中相关细胞内的调控因子有机会使得肿瘤细胞对顺铂、吉西他滨等药物的敏感性增加。

RRM2存在于多数真核细胞中，是蛋白质翻译后修饰酶，亦是促进DNA合成与修复的关键限速酶，在生物学行为中，RRM2对DNA损伤修复与细胞凋亡有重要的影响，已有大量临床荟萃分析[11-13]表明RRM2与癌肿生物学行为有直接相关性。寻庆英等[14]检测到了RRM2在子宫内膜癌中的表达部位和表达水平均可影响Ishikawa细胞增殖及侵袭能力，并以基因的mRMA证实其存在着高表达，并推测可通过阻断RRM2的表达来抑制肿瘤的发生、发展和治疗效果。目前，RNA干扰技术是一项特异性抑制基因表达的成熟方法，又为被称为基因沉默疗法，与传统的抑制基因功能的治疗方案相比，尤其是一些短的双链RNA即 siRNA具有快速、高效、特异地降解相关基因的mRNA等特点[15]。陈昌贤等[16]的研究亦基于microRNA调控网络分析预测卵巢癌多药耐药的相关基因。RNA以DNA的一条链为模板，具有实现遗传信息在蛋白质上表达作用，而指外源性或内源性的双链RNA与细胞内含有互补序列的mRNA识别并结合后可在酶的作用下降解mRNA，从而产生干扰相应基因表达、发挥基因敲除的功能，如卵巢癌SKOV3细胞侵袭能力和增殖能力可受siRNA干扰的影响，主要与siRNA可有效逆转肿瘤细胞的耐药性有关[17]。另一方面，卵巢癌细胞SKOV3增殖和迁移能力常常与耐药有关，在相关基因实验[18]中常见报道。本研究中，空白组、阴性组及干扰组转染率均>90%。DDP对SKOV3/DDP细胞属低度耐药，吉西他滨对SKOV3/DDP细胞仍较为敏感，结合转染Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ 组SKOV3/DDP细胞、SKOV3细胞RRM2蛋白的相对表达量，可分析卵巢癌SKOV3细胞RRM2蛋白呈过量表达，且其与患者耐药具有密切的关系，同时选择有效的基因沉默靶序列对研究该基因的生物学功能有重要影响。王兆永等[19]分析指出，RRM2蛋白呈过量表达可预测肿瘤耐药性与治疗效果不佳，与龙映妃等[20]关于卵巢癌SKOV3细胞RRM2表达的相关研究结论一致。

本研究中, SKOV3/DDP细胞、SKOV3细胞RRM2蛋白的相对表达量比较，差异有统计学意义(P<0.05), 且转染Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ 组相对表达量均显著低于阴性组、空白组，其中以转染Ⅰ组细胞的RRM2蛋白相对表达量下降最显著(P<0.05)。表明转染RRM2的siRNA转染后可能通过降解靶标基因而封闭RRM2基因表达，并阻断其活性，从而在转录和翻译水平分别起到抑制RRM2蛋白表达的作用。DDP、吉西他滨对干扰组、阴性组、空白组的DDP对细胞的半数抑制浓度(IC50)值比较，差异有统计学意义(P<0.05), DDP、吉西他滨对干扰组细胞的IC50值显著低于阴性组、空白组(P<0.05)。提示转染RRM2-RNAi可逆转SKOV3/DDP的DDP耐药性，使细胞对DDP的敏感性显著增加，亦说明RRM2在卵巢癌化疗耐药中有负面作用，因此可作为改善DDP耐药的治疗分子靶点之一。张梦等[21]的实验亦证实了这一观点。因此，通过siRNA技术阻断RRM2基因在卵巢癌化疗DDP耐药细胞SKOV3/DDP中的表达程度，结果显示干扰组细胞凋亡率显著高于空白组、阴性组，穿膜细胞数显著低于空白组、阴性组(P<0.05)。表明siRNA可有效抑制RRM2基因在卵巢癌中的增殖率与侵袭性，增加其凋亡率，尤其是促进DDP诱导的耐药细胞凋亡，故有望应用于卵巢癌化疗并改善耐药、降低复发的一线治疗方案。

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Influence of RNA-interfered ribonucleotide reductase M2 on apoptosis and invasion of ovarian cancer cells with drug resistant

LIU Qing1, NIU Ru2, JING Songmei3

(1.DepartmentofGynecology; 2.DepartmentofAnorectalDisease; 3.DepartmentofOrthopedics,XuzhouCentralHospital,Xuzhou,Jiangsu, 221009)

Objective To investigate the influence of RNA-interfered ribonucleotide reductase M2 (RRM2) on apoptosis and invasion of ovarian cancer cells with drug resistant. Methods The specific small interfering (siRNA) transfected SKOV3/DDP of RRM2 gene were designed as the interference group. SKOV3/DDP cells, SKOV3/DDP-RRM2 non-specific negative cells were designed as the blank group and negative group. The cell proliferation inhibition rate was detected, RI and drug resistant transfection rate were calculated, the expression of RRM2 mRNA was detected by fluorescence PCR. The effect of siRNA transfection on SKOV3/DDP resistance index and RRM2 protein was analyzed, and the invasion ability of SKOV3/DDP cells was observed with Transwell. Results The transfection rate of the blank group, negative group and interference group was 90%. The drug resistance of DDPto SKOV3/DDP cells was low and gemcitabine was sensitive to SKOV3/DDP cells. DDP and gemcitabine of the DDP on cell half inhibitory concentration (IC50) values showed significant differences among three groups (P<0.05). IC50values of DDP and gemcitabine on cells in the interference group were significantly lower than the negative group and blank group (P<0.05).The relative expression of SKOV3/DDP cells and SKOV3 cells RRM2 protein showed significantdifferences (P<0.05), and the relative expression was significantly lower in transfection group I, transfection group II and transfection group III than the negative group and blank group (P<0.05). The decrease of relative expression of RRM2 protein was the greatest in the transfection group I (P<0.05). The apoptosis rate was significantly higher in the interference group than the blank group and the negative group, transmembrane cells were fewer than the blank group and the negative group (P<0.05). Conclusion siRNA can effectively inhibit the proliferation and invasion of RRM2 gene in ovarian cancer. It can increase the drug sensitivity of drug resistant cells, especially cells promoting the apoptosis of drug resistant cells induced by DDP.

siRNA; ribonucleotide reductase M2; ovarian cancer; drug resistance; apoptosis

2017-03-16

江苏省徐州中心医院创团队科技项目 (XZS201626)

井松梅

R 737.31

A

1672-2353(2017)13-067-05

10.7619/jcmp.201713018