miR-34a对结肠癌细胞SW480增殖、迁移和侵袭能力的影响及机制探讨

郝小军 王传卓 赵相轩 辛 鹤 刘兆玉

·基础研究·

miR-34a对结肠癌细胞SW480增殖、迁移和侵袭能力的影响及机制探讨

郝小军 王传卓 赵相轩 辛 鹤 刘兆玉

目的 探讨miR-34a对结肠癌细胞株SW480增殖、侵袭和迁移能力的影响及可能的作用机制。方法 将miR-34a过表达慢病毒、空病毒载体转染SW480细胞，未做处理细胞作为空白对照组。Real-time PCR检测各组细胞内miR-34a的表达；CCK8法检测细胞增殖能力；划痕实验、Transwell小室实验检测细胞迁移和侵袭能力；Western blot实验检测细胞内E-cadherin和Vimentin蛋白表达。结果 与空病毒载体组及空白对照组相比，转染组细胞中miR-34a的表达增高，且细胞增殖效率、侵袭和迁移能力降低(P<0.05)，miR-34a使E-cadherin蛋白表达增加、Vimentin蛋白表达降低。结论 miR-34a可抑制结肠癌细胞SW480增殖、侵袭和迁移能力，并能影响E-cadherin和Vimentin的表达，miR-34a有望成为干预结肠癌转移和复发的分子靶点。

结直肠癌；miR-34a；EMT；增殖；侵袭

结直肠癌是消化道最常见的恶性肿瘤之一，近年来，其在我国的发病率和死亡率呈上升趋势[1]，转移和复发是其预后差的重要原因。miRNA是一类内源性非编码小RNA分子，在转录后水平调控基因的表达，参与众多生理及病理过程。大量研究表明，miRNA在肿瘤发生发展中发挥重要作用，包括调控肿瘤细胞的增殖、凋亡、分化、侵袭和转移等生物学过程[2]。结直肠癌发生转移的分子机制复杂，文献报道上皮-间质转化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)是肿瘤转移的关键步骤之一，机制在于细胞间的黏附性下降，细胞获得更强的运动、侵袭迁移能力[3]。研究表明，相对比正常结肠组织，miR-34a在结肠癌组织中表达下调[4]。但miR-34a在结肠癌转移复发中的作用机制并未研究透彻。miR-34a与EMT相关蛋白上皮钙黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)研究尚少。本研究拟通过慢病毒转染技术，研究miR-34a的过表达对结肠癌细胞SW480增殖、迁移和侵袭的影响及细胞中EMT相关蛋白表达的变化，探讨可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞与试剂

结肠癌细胞SW480(上海中科院细胞库)，RPMI1640培养基、胎牛血清(Gbico公司)，miR-34a过表达慢病毒、空载慢病毒(上海吉凯基因公司)，Matrigel基质胶、Transwell小室(Corning公司)，CCK8试剂(北京碧云天公司)，miRNA提取分离、cDNA合成及荧光定量检测试剂盒(北京天根公司)，miR-34a和U6引物(上海生工公司)，E-cadherin、Vimentin及β-actin抗体(Santa cruz公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 用含10%胎牛血清和1%青-链霉素双抗的RPMI 1640在37℃、5% CO2的培养箱中培养，常规换液、传代。

1.2.2 细胞转染 按照慢病毒操作手册进行预实验，确定转染的最佳MOI值，然后正式转染。具体为：选取对数生长且状态良好的细胞，以1×105/孔的细胞数接种到六孔板中，待细胞融合20%～30%时，将miR-34a过表达慢病毒、空载慢病毒按照预实验确定的MOI值感染细胞，加入polybrene增强感染效率，12 h后换液，感染72～96 h后，观察GFP荧光。待细胞生长状态良好，且荧光率≥90%时，对细胞收集、扩大培养，用于后续试验。转染率(%)=荧光视野绿色细胞数/对应白光视野细胞总数×100%。

1.2.3 RT-PCR 按照试剂盒说明书提取各组细胞总RNA、合成cDNA，进行RT-PCR反应。RT-PCR反应条件：94℃起始模板变性2 min，94℃循环中模板变性20 s，60℃退火、延伸34s，共40个循环，以U6为内参。miR-34a引物序列：上游5′-CCCACATTTCCTTCTTATCAACAG-3′，下游5′-TGGCAGTGTCTTAGCTGGTTGTG-3′。U6引物序列：上游5′-CGCTTCGGCAGCACATATACTA-3′，下游5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCA-3′。得到各样本的Ct值，以2-ΔΔCt法计算每组细胞miR-34a的相对表达量，每组设3个复孔。

1.2.4 CCK-8实验 将细胞以5×103个/孔接种到96孔板上，连续培养4d，每孔加入10 μL CCK8试剂与90 μL培养液，培养箱内反应2 h后，酶标仪测定在490 nm处波长的吸光度(A)，每组设6个复孔，取平均值，实验重复3次。

1.2.5 划痕实验 将细胞以5×105/孔接种到6孔板中，待细胞汇合90%时，用10 μL移液枪枪头垂直于每孔中轴线划直线，PBS洗3次，加入无血清培养液，并拍照(0 h)，继续培养48 h后观察各组细胞迁移情况并拍照，实验重复3次。

1.2.6 Transwell侵袭实验 用无血清培养基稀释Matrigel胶，以50 μL/孔的体积铺于Transwell小室聚碳酸酯膜上，37℃放置4 h，使Matrigel聚合成胶。细胞饥饿24 h后调整浓度为5×105个/mL，上室加入200 μL细胞悬液，下室加入600 μL含20%FBS的培养液。孵箱中培养24 h后取出小室，用湿棉签擦去上室Matrigel胶和未穿过膜的细胞，4%多聚甲醛固定15 min，0.1%结晶紫染色15 min，PBS清洗3次、干燥，取下微孔滤膜，倒置显微镜下随机选取5个视野计数穿过膜的细胞并拍照，取平均数，实验重复3次。

1.2.7 Western blot实验 细胞长满后，提取总蛋白，BCA法蛋白定量，电泳、转膜、脱脂奶粉封闭后，分别加入各目标蛋白一抗4℃孵育过夜，与辣根过氧化酶标记二抗室温反应、孵育后，利用胶片曝光、显影、定影，图像分析仪行胶片扫描，分析灰度值。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 转染及各组miR-34a的表达

当MOI值为50 TU/mL，转染SW480细胞72 h后，miR-34a转染组与空病毒载体组均可观察到GFP绿色荧光，转染率达90%以上(图1)。RT-PCR检测各组细胞miR-34a的表达，假设空白对照组表达为1，转染组miR-34a的相对表达量为9.29±0.48，空病毒载体组相对表达量为1.13±0.06，转染组miR-34a的表达高于其他两组，差异有统计学意义(P<0.01)，而空载体组与空白对照组比较无统计学差异(P>0.05)(图2)。

2.2 miR-34a对细胞增殖能力影响

CCK8法结果显示随培养时间的延长，过表达miR-34a组细胞的增殖能力从第3天后开始比空载体组和空白对照组下降，差异有统计学意义(P<0.05)，提示miR-34a具有抑制结肠癌细胞SW480增殖的能力(图3)。

图1 SW480细胞转染后的细胞状态及GFP绿色荧光表达(200×)Figure 1 W480 cells were transfected with miR-34a and observed cell morphology with white bright(left)and green fluorescence(right)(200×)

图2 RT-PCR检测转染后miR-34a的相对表达量Figure 2 Relative expression levels of miR-34a in blank，empty virus vector and transfected cells were detected by RT-PCR.Note：Compared with blank group and vector group，*P<0.05.

图3 CCK-8检测miR-34a对结肠癌SW480增殖能力的影响Figure 3 Effect of miR-34a on proliferation SW480 cellsNote：*P<0.05，compared to the blank and vector group.

2.3 划痕实验检测miR-34a对细胞迁移能力影响

划痕实验结果显示，划痕48 h后，空白对照组、空病毒载体组及miR-34a转染组划痕区域相对宽度分别为(57.33±2.85)%、(52.54±1.77)%、(70.79±3.35)%。miR-34a转染组划痕细胞两端距离较其他两组宽，差异有统计学意义(P<0.05)(图4)，而空白对照和空病毒载体组无统计学差异(P>0.05)，表明miR-34a可抑制SW480细胞的迁移能力。

2.4 Transwell小室检测miR-34a对细胞侵袭能力影响

Transwell小室结果显示，miR-34a转染组穿过滤膜的数量(83.00±7.44个)，较空白对照组(116.20±9.58个)、空病毒载体组(113.20±6.28个)减少，差异有统计学意义(P<0.05)，而空白对照组与空病毒载体组差异无统计学意义(P>0.05)，表明miR-34a可以抑制结肠癌SW480的侵袭能力(图5)。

2.5 各组细胞E-cadherin和Vimentin蛋白表达

Western blot结果显示，上调miR-34a水平后，与空病毒载体组及空白对照相比，转染组E-cadherin的表达增加，而Vimentin表达降低(P<0.05)，而空病毒载体组及空白对照则无统计学差异(P>0.05)(图6)。

图4 划痕实验检测miR-34a对SW480迁移能力影响Figure 4 Effects of miR-34a on the mobility in SW480 cells

图5 Transwell小室检测miR-34a对SW480侵袭能力影响Figure 5 Effect of miR-34a on invasion ability of SW480 cellsNote：1.Blank group；2.Vector group；3.MiR-34a group；*P<0.05 compared with vector and blank group

图6 Western blot检测E-cadherin和Vimentin的表达Figure 6 The expression of E-cadherin and Vimentin protein in SW480 cells

3 讨论

结直肠癌是全球范围内致死性最高的恶性肿瘤之一，复发和转移是患者预后不良的重要原因，其中远处转移以肝转移最常见，文献报道约有30%的患者会发生肝转移[5]。结直肠癌的转移分子机制复杂，它是一个多步骤、多阶段、多途径、多个因素共同调控的生物学过程。miRNA是一类高度保守的非编码小RNA分子，可与下游靶基因3′UTR区序列互补配对，引起靶基因的降解或抑制靶基因的翻译。miRNA的表达异常与肿瘤的发生、侵袭转移及复发密切相关，扮演抑癌基因或致癌基因的角色[6]。因此miRNA可能是复杂基因调控网络中的关键节点，是肿瘤诊断、治疗新的分子标志及作用靶点。

miR-34a是一个受抑癌基因p53调节的小分子RNA，研究显示miR-34a在多种恶性肿瘤组织中呈低表达，参与调控多种肿瘤细胞的生物学行为，如抑制胃癌、乳腺癌、肝癌等细胞的增殖及迁移侵袭[7-9]，miR-34a也与结直肠癌的临床分期、分化和浸润程度、淋巴结转移及复发密切有关[11]。本研究通过慢病毒技术，成功构建了miR-34a稳定过表达的结肠癌SW480细胞系，应用CCK8法、划痕实验及Transwell侵袭实验证实miR-34a可抑制SW480细胞的增殖、迁移及侵袭。

EMT指上皮细胞在特定环境下，失去上皮特性而获得间质细胞特性的生物学现象。EMT在个体发育、伤口修复、组织再生、干细胞分化及器官纤维化等过程中起着重要作用[11]。近年来，研究发现EMT是肿瘤细胞发生侵袭和转移的机制之一。当细胞发生EMT时，细胞的骨架发生重组，上皮细胞表型缺失，增强细胞间黏附的蛋白如E-cadherin表达减少，间质细胞的分子标志如Vimentin、基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinase，MMPs)及N-钙黏蛋白(N-cadherin)表达增加，导致细胞间黏附能力下降或丧失、连接松散、失去极性，获得更强的游走、抗凋亡及降解细胞外基质的能力，这是肿瘤发生周围侵袭及远处转移的重要生物学过程[12]。近年来，多个miRNA被发现参与调控EMT过程从而影响肿瘤的侵袭转移，其中以miR-200家族最为经典。miR-200家族可与E-cadherin的转录抑制因子ZEB1和ZEB2的3′UTR互补序列结合，增强E-cadherin的表达，抑制细胞的侵袭能力[13]。本研究结果表明过表达的miR-34a能促进SW480细胞E-cadherin的表达，抑制Vimentin的表达。

综上所述，上调结肠癌SW480细胞miR-34a表达后，细胞的增殖、迁移和侵袭能力下降，miR-34a可抑制间质细胞相关蛋白Vimentin的表达，促进细胞间黏附蛋白E-cadherin的表达。由此推断miR-34a抑制结肠癌细胞SW480增殖、迁移及侵袭的机制可能是通过抑制EMT过程实现的。由此提示我们，miR-34a的低表达很可能存在高转移及复发风险，miR-34a可能成为结肠直肠癌治疗新的分子靶点。

1 Chen W，Zheng R，Baade PD，et al.Cancer statistics in China，2015[J].CA Cancer J Clin，2016，66(2)：115-132.

2 Berindan Neagoe I，Monroig PC，Pasculli B，et al.MicroRNAome genome：a treasure for cancer diagnosis and therapy[J].Cancer J Clinicians，2014，64(5)：311-336.

3 Kouso H，Yano T，Maruyama R，et al.Differences in the expression of epithelial-mesenchymal transition related molecules between primary tumors and pulmonary metastatic tumors in colorectal cancer[J].Surgery Today，2012，43(1)：73-80.

4 Zhang D，Zhou J，Ming D.Dysregulation of microRNA-34a expression in colorectal cancer inhibits the phosphorylation of FAK via VEGF[J].Digest Dis Sci，2014，59(5)：958-967.

5 Sahani DV，Bajwa MA，Andrabi Y，et al.Current status of imaging and emerging techniques to evaluate liver metastases from colorectal carcinoma[J].Annal Surgery，2014，259(5)：861-872.

6 Lu J，Getz G，Miska EA，et al.MicroRNA expression profiles classify human cancers[J].Nature，2005，435(7043)：834-838.

7 Cao W，Fan R，Wang L，et al.Expression and regulatory function of miRNA-34a in targeting survivin in gastric cancer cells[J].Tumor Biology，2013，34(2)：963-971.

8 Si W，Li Y，Shao H，et al.MiR-34a inhibits breast cancer proliferation and progression by targeting Wnt1 in Wnt/β-catenin signaling pathway[J].Am J Med Sci，2016，352(2)：191-199.

9 Li N，Fu H，Tie Y，et al.miR-34a inhibits migration and invasion by down-regulation of c-Met expression in human hepatocellular carcinoma cells[J].Cancer Letters，2009，275(1)：44-53.

10 Gao J，Li N，Dong Y，et al.miR-34a-5p suppresses colorectal cancer metastasis and predicts recurrence in patients with stage Ⅱ/Ⅲ colorectal cancer[J].Oncogene，2015，34(31)：4142-4152.

11 Nieto MA.Epithelial plasticity：a common theme in embryonic and cancer cells[J].Science，2013，342(6159)：1234850.

12 Wrighton KH.Cell migration：EMT promotes contact inhibition of locomotion[J].Nat Rev Mol Cell Biol，2015，16(9)：518.

13 Davalos V，Moutinho C，Villanueva A，et al.Dynamic epigenetic regulation of the microRNA-200 family mediates epithelial and mesenchymal transitions in human tumorigenesis[J].Oncogene，2012，31(16)：2062-2074.

(收稿：2016-12-29)

Effects of miR-34a on proliferation，migration and invasion of colon cancer SW480 cell and its possible mechanism

HAOXiaojun，WANGChuanzhuo，ZHAOXiangxuan，XINhe，LIUZhaoyu

Department of Radiology，Shengjing Hospital of China Medical University，Shenyang 110004，China

Objective The objective of this study was to investigate effects of miR-34a on the proliferation，invasion and migration of colon cancer SW480 cell and its possible mechanism.Methods miR-34a overexpressed lentivirus and empty virus vector were transfected into SW480 cells and untreated cells were used as blank control group.Real-time PCR was used to detect the expression of miR-34a in each group.The cell proliferation was detected by CCK8 assay.The cell migration and invasion ability were detected by wound healing and transwell assays.The expression of E-cadherin and Vimentin protein was detected by Western blotting.Results Compared with the empty virus vector group and the blank control group，the expression of miR-34a was increased in the transfected cells，and the cell proliferation efficiency，invasion and migration ability were decreased in the transfected cells(P<0.05).miR-34a significantly increased the expression of E-cadherin protein and decreased Vimentin protein expression in the transfected cells.Conclusion miR-34a can inhibit the proliferation，invasion and migration of colon cancer SW480 cells，and affect the expression of E-cadherin and Vimentin.MR-34a is expected to be a potential molecular target for the metastasis and recurrence of colorectal cancer.

Colorectal cancer；miR-34a；EMT；Proliferation；Invasion

国家自然科学基金(81470086)

中国医科大学附属盛京医院放射科(沈阳 110004)

郝小军，男，(1990-)，硕士研究生，从事肿瘤介入治疗和影像诊断的研究。

刘兆玉，E-mail：liuzy@sj-hospital.org

R735.3

A

10.11904/j.issn.1002-3070.2017.03.001