大豆粕玉米黄粉发酵物对小鼠免疫功能的影响

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(江苏大学食品与生物工程学院,江苏镇江 212013)



大豆粕玉米黄粉发酵物对小鼠免疫功能的影响

黄姗芬,马海乐,杨雪,王禹程,李云亮*

(江苏大学食品与生物工程学院,江苏镇江 212013)

目的:研究大豆粕玉米黄粉枯草芽孢杆菌发酵物对小鼠免疫功能的影响。方法:实验组以低、中、高剂量0.334、0.667和2 g/(kg·d)的大豆粕玉米黄粉枯草芽孢杆菌发酵物灌胃小鼠,对照组以等体积纯净水灌胃,30 d后进行二硝基氟苯诱导小鼠迟发性变态反应实验、ConA 诱导小鼠脾淋巴细胞转化实验、抗体生成细胞检测实验、血清溶血素测定实验、碳廓清实验和NK 细胞活性测定实验。结果:大豆粕玉米黄粉枯草芽孢杆菌发酵物对小鼠的耳廓肿胀、脾淋巴细胞转化、血清溶血素水平、吞噬指数a和NK细胞活性都有显著影响(p<0.05),但是对小鼠脾抗体生成细胞量无显著影响(p>0.05)。结论:大豆粕玉米黄粉枯草芽孢杆菌发酵物具有增强免疫力的功能。

大豆粕,玉米黄粉,发酵物,枯草芽孢杆菌,增强免疫力

我国是一个农业大国,玉米和大豆资源丰富,玉米年产量1.25亿吨,大豆年产量2千万吨。玉米黄粉是玉米加工淀粉时剩下的副产物,其中含有40%～60%的蛋白质。大豆粕是大豆榨油后的副产物,其中蛋白含量43%～48%[1]。由于玉米蛋白中赖氨酸和色氨酸含量较低,导致其蛋白质生物学营养价值较低[2]。然而,大豆蛋白中含有较为丰富的赖氨酸和色氨酸,但是含硫氨基酸较少[3-4]。玉米蛋白的含硫氨基酸比较丰富[2]。不同食物来源的蛋白质其营养价值不同(取决于该蛋白质中必需氨基酸的含量与比值)。蛋白质的互补作用是将几种生物学价值较低的食物蛋白质混合食用,则混合后蛋白质的总体生物学价值就能大大提高。由于当必需氨基酸的含量与比值接近人体组织蛋白质氨基酸的组成和比值时,其利用率高,营养价值就大。但是有些蛋白质,因一种或几种必需氨基酸的含量过低或过高,比值与人体组织不接近,则利用率低,生物学价值低。

如果将大豆粕和玉米黄粉一起发酵,能有效克服氨基酸缺陷问题。由于大豆粕中主要成分为大豆蛋白,玉米黄粉主要成分为玉米蛋白,其中大豆蛋白和玉米蛋白具有互补作用。互补的蛋白质氨基酸含量丰富且组成均衡,营养价值高,而且无论是其生物效价还是利用率都很高。王进[5]等人发现,玉米大豆复配肽比单一原料制备的肽的ACE抑制活性高。

近年来,为促进大豆粕和玉米黄粉的高值化利用,采用微生物发酵法制备功能性多肽已成为研究热点问题之一[6-9]。目前大量研究结果表明,大豆和玉米蛋白多肽都具有降血压[10-15]、抗氧化[16-21]、提高免疫力[22-25]等功效。

对于大豆粕玉米黄粉枯草芽孢杆菌发酵物增强免疫功能的研究,目前还未见报道,且大多文献关于大豆和玉米蛋白多肽对免疫功能的影响的研究不透彻[22-25]。本文详细探讨了大豆粕玉米黄粉枯草芽孢杆菌发酵物对增强免疫功能的具体效果,为蛋白多肽高值化应用提供了理论基础。

1 材料与方法

1.1材料与仪器

枯草芽孢杆菌 本课题组实验室提供;大豆粕(蛋白含量42.53%) 中储粮镇江粮油有限公司;玉米黄粉(蛋白含量60.17%) 山东无棣天成生物科技有限公司;小牛血清、刀豆蛋白A(ConA)、四氮唑蓝(MTT)、2-巯基乙醇(2-ME)、2,4-二硝基氟苯(DNFB) Sigma试剂公司;绵羊红细胞(SRBC) 北京百奥莱博科技有限公司;18.0～22.0 g健康雌性清洁级ICR小鼠 动物生产许可证号:SCXK(沪)2012-0002号，上海斯莱克实验动物有限公司。

MSS全波长酶标仪 美国热电·芬兰雷勃(Thermo Labsystems Co);SPX-250B生化培养箱 常州国华电器有限公司。

1.2实验方法

1.2.1 豆粕玉米黄粉枯草芽孢杆菌发酵物的制备 样品豆粕玉米黄粉枯草芽孢杆菌发酵物的制备参考朱宏志[26]等的方法。

1.2.2 实验分组和豆粕玉米黄粉枯草芽孢杆菌发酵物剂量设计

1.2.2.1 动物分组 分批按体重随机各分为4组测定:二硝基氟苯诱导小鼠迟发性变态反应实验;ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验;抗体生成细胞检测和血清溶血素测定;小鼠碳廓清实验和NK细胞活性测定。

1.2.2.2 剂量设计 成人(按60 kg体重计)每日推荐摄入量为4 g,相当于0.0667 g/(kg·d)。实验按低、中、高设置0.334、0.667和2 g/(kg·d)3个剂量组,分别相当于人体推荐量的5、10和30倍。溶剂对照组以等体积纯净水灌胃。

1.2.2.3 受试物的前处理 称取样品大豆粕玉米黄粉枯草芽孢杆菌发酵物3.34、6.67和20 g,分别加纯净水至200 mL制成各组受试液混匀后灌胃(存放于4 ℃冰箱,每两天配制一次)。各组小鼠以20 mL/(kg·d)的灌胃容积,连续经口灌胃30 d后测其各项免疫指标。

1.2.3 细胞免疫功能实验

1.2.3.1 二硝基氟苯诱导小鼠迟发性变态反应 参照葛飞[27]的方法略有改动。采用1% DNFB丙酮麻油溶液涂抹受试动物耳廓,使其致敏。

1.2.3.2 ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验 采用MTT测定法[28],略有改动。用于显色测定受试动物脾淋巴细胞的增殖细胞数量。

1.2.4 体液免疫功能实验

1.2.4.1 抗体生成细胞检测 采用Jerne改良载片测定法[29]。通过对小鼠腹腔注射SRBC,刺激其脾细胞产生SRBC抗体,将该脾细胞与SRBC进行溶血空斑实验,并计算溶血空斑数。

1.2.4.2 血清溶血素测定 采用半数溶血值(HC50)测定法[27],略有改动,其中以SA缓冲液代替血清设为对照。通过对小鼠腹腔注射SRBC,使其血清产生SRBC抗体,其血清与SRBC发生溶血反应,并释放血红蛋白,检测其半数溶血时的光密度值。

1.2.5 非特异性免疫功能实验

1.2.5.1 碳廓清实验 参照白玉[28]的方法略有改动,其中印度墨汁∶生理盐水调整为1∶7(v/v)。在一定浓度范围内,体内碳颗粒被清除的速率与血碳浓度呈指数函数关系。从小鼠尾静脉注射墨汁,2 min和10 min后分别测其血液的OD值。

1.2.5.2 NK细胞活性测定 参照白玉[28]的方法略有改动。其中靶细胞最大释放孔加2.5% Triton。通过脾细胞悬液与靶细胞反应,释放乳酸脱氢酶,发生显色反应,检测其光密度值。

2 结果与分析

2.1豆粕玉米黄粉枯草芽孢杆菌发酵物对小鼠耳廓迟发性变态反应的影响

豆粕玉米黄粉枯草芽孢杆菌发酵物对小鼠耳廓迟发性变态反应的影响见表1。各剂量组小鼠耳廓肿胀程度均高于溶剂对照组,低、中、高剂量组小鼠耳廓肿胀程度与溶剂对照组相比均有统计学显著性差异(p<0.05)。迟发型超敏反应是以单个核细胞浸润和组织细胞损伤为主要特征的细胞免疫反应[30],二硝基氟苯为抗原刺激T淋巴细胞增殖分化为致敏T细胞,产生细胞免疫。由此说明低、中、高剂量豆粕玉米黄粉枯草芽孢杆菌发酵物对小鼠细胞免疫具有增强作用。

表1 豆粕玉米黄粉枯草芽孢杆菌发酵物对小鼠耳廓迟发性变态反应的影响Table 1 Effect of soybean meal corn yellow powder fermentation of Bacillus subtilison mouse pinna delayed hypersensitivity

注:*与空白对照组比较,有显著性差异(p<0.05);**与空白对照组比较,有极显著性差异(p<0.01)，表2～表6同。

表2 豆粕玉米黄粉枯草芽孢杆菌发酵物对小鼠脾淋巴细胞增殖能力的影响Table 2 Effect of soybean meal corn yellow powder fermentation of Bacillus subtilis on mouse spleen lymphocyte blastogenesis

2.2豆粕玉米黄粉枯草芽孢杆菌发酵物对小鼠脾淋巴细胞增殖能力的影响

豆粕玉米黄粉枯草芽孢杆菌发酵物对小鼠脾淋巴细胞增殖能力的影响见表2。各剂量组光密度差值均高于溶剂对照组,只有高剂量组小鼠光密度差值与溶剂对照组相比有极显著性差异(p<0.01)。由此说明高剂量豆粕玉米黄粉枯草芽孢杆菌发酵物对小鼠脾淋巴细胞具有增殖作用。

2.3豆粕玉米黄粉枯草芽孢杆菌发酵物对小鼠脾抗体生成细胞量的影响

豆粕玉米黄粉枯草芽孢杆菌发酵物对小鼠脾抗体生成细胞量的影响见表3。与溶剂对照组相比,各剂量组小鼠的溶血空斑数均无显著性差异(p>0.05)。成熟的B细胞定居于脾脏,B细胞在抗原刺激下分化为浆细胞,浆细胞合成和分泌抗体,主要执行机体的体液免疫。由此说明豆粕玉米黄粉枯草芽孢杆菌发酵物对小鼠的体液免疫(抗原直接作用B细胞产生抗体)无促进作用。

表3 豆粕玉米黄粉枯草芽孢杆菌发酵物对小鼠脾抗体生成细胞量的影响Table 3 Effect of soybean meal corn yellow powder fermentation of Bacillus subtilison cells production of antibody of mouse spleen

2.4豆粕玉米黄粉枯草芽孢杆菌发酵物对小鼠血清溶血素水平的影响

豆粕玉米黄粉枯草芽孢杆菌发酵物对小鼠血清溶血素水平的影响见表4。各剂量组小鼠血清半数溶血值(HC50)均高于溶剂对照组,中、高剂量组小鼠血清半数溶血值(HC50)与溶剂对照组相比有显著性差异(p<0.05)。SRBC刺激T细胞的活化增殖,在T细胞的辅助下,B细胞活化分泌抗体[31]。由此说明豆粕玉米黄粉枯草芽孢杆菌发酵物对小鼠的体液免疫(抗原作用T细胞,刺激B细胞间接产生抗体)有促进作用。

表4 豆粕玉米黄粉枯草芽孢杆菌发酵物对小鼠血清溶血素水平的影响Table 4 Effect of soybean meal corn yellow powder fermentation of Bacillus subtilison serum level of hemolysin

2.5豆粕玉米黄粉枯草芽孢杆菌发酵物对小鼠碳廓清的影响

豆粕玉米黄粉枯草芽孢杆菌发酵物对小鼠碳廓清的影响见表5。各剂量组小鼠吞噬指数a均高于溶剂对照组,中、高剂量组小鼠的吞噬指数a与溶剂对照组相比有极显著性差异(p<0.01)。由血液中碳粒消失速度反映单核-巨噬细胞吞噬异物能力,是非特异性免疫。由此说明中、高剂量豆粕玉米黄粉枯草芽孢杆菌发酵物对血液中的非特异性免疫具有促进作用。

表5 豆粕玉米黄粉枯草芽孢杆菌发酵物对小鼠碳廓清的影响Table 5 Effect of soybean meal corn yellow powder fermentation of Bacillus subtilison mouse carbon clearance(±s)

2.6豆粕玉米黄粉枯草芽孢杆菌发酵物对小鼠NK细胞活性的影响

豆粕玉米黄粉枯草芽孢杆菌发酵物对小鼠NK细胞活性的影响见表6。高剂量组小鼠NK细胞活性与溶剂对照组相比有显著性差异(p<0.05)。由此说明高剂量豆粕玉米黄粉枯草芽孢杆菌发酵物对NK细胞的杀伤活性有促进作用。

表6 豆粕玉米黄粉枯草芽孢杆菌发酵物对小鼠NK细胞活性的影响Table 6 Effect of soybean meal corn yellow powder fermentation of Bacillus subtilison mouse NK cell activity(±s)

3 结论与讨论

本文通过对细胞免疫功能、体液免疫功能、非特异性免疫的研究,探索了豆粕玉米黄粉枯草芽孢杆菌发酵物对小鼠免疫功能的影响。实验结果表明,高剂量的豆粕玉米黄粉枯草芽孢杆菌发酵物对小鼠细胞免疫功能有显著的增强作用,耳廓迟发性变态反应和脾淋巴细胞增殖反应可以作为机体细胞免疫功能的参考指标。中、高剂量的豆粕玉米黄粉枯草芽孢杆菌发酵物对小鼠间接产生抗体的体液免疫功能有显著的增强作用,但是对小鼠直接产生抗体的体液免疫功能无明显作用。高剂量的豆粕玉米黄粉枯草芽孢杆菌发酵物对小鼠非特异性免疫功能有显著的增强作用,碳廓清实验和NK细胞活性可以作为机体非特异性免疫功能的参考指标。

目前豆粕玉米黄粉枯草芽孢杆菌发酵物增强免疫力功能的研究未见报道,富校轶[23]等人研究发现超滤大豆蛋白肽具有增强免疫功能中体液免疫功能和单核-巨噬细胞吞噬功能的作用,吴晓萌[24]发现玉米肽具有同样的免疫功能,但是该研究对于蛋白多肽增强免疫力功能的影响机制研究不透彻。本文研究了豆粕玉米黄粉枯草芽孢杆菌发酵物对小鼠细胞免疫功能、体液免疫功能和非特异性免疫功能均有较好的增强作用,为探索将豆粕玉米黄粉枯草芽孢杆菌发酵物应用于保健品领域,提供可靠的理论支撑。

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Effectofsoybeanmealcornyellowpowderfermentationonmouseimmunefunction

HUANGShan-fen,MAHai-le,YANGXue,WANGYu-cheng,LIYun-liang*

(School of Food and Biology Engineering,Jiangsu University,Zhenjiang 212013,China)

Objective:To study the effect of soybean meal and corn yellow powder fermentation ofBacillussubtilison immune function of mice. Methods:Low-,medium-and high-dosage group were fed with 0.334,0.667 and 2 g/(kg·d)soybean meal and corn yellow powder fermentation ofBacillussubtilis,respectively,equal volume of pure water as control group. 30 days later,the following experiments were conducted that DNFB induced mouse delayed type hypersensitivity,mouse spleen lymphocyte transformation capacity induced by ConA,antibody forming spleen cells,serum hemolysin,carbon clearance ability,NK cell activity. Results:Soybean meal and corn yellow powder fermentation ofBacillussubtilishas significant impact(p<0.05) on mouse carbon clearance ability,spleen lymphocyte transformation,serum hemolysin capacity,phagocytic index a and NK cell activity. However it had no significant effect on production of spleen cells formed by antibody(p>0.05). Conclusions:Soybean meal and corn yellow powder fermentation ofBacillussubtilishad effect on enhancing immunity.

soybean meal;corn yellow powder;fermentation;Bacillussubtilis;enhance immunity

2016-11-28

黄姗芬(1992-)，女，在读硕士研究生,研究方向：多肽提取及功能评价，E-mail:839710769@qq.com。

*通讯作者:李云亮(1986-)，男，博士研究生,讲师，主要从事功能食品、食品物理学加工方法及装备的开发方面的研究，E-mail:liyunliang1986@126.com。

国家863计划-高生物利用度蛋白制备关键技术研究与开发(2013AA102203)；江苏大学高级人才科研启动基金(16JDG049)。

TS201.4

:A

:1002-0306(2017)12-0319-04

10.13386/j.issn1002-0306.2017.12.059