HPLCICPMS法测定香菇及培养料中不同形态砷的含量

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(1.三明出入境检验检疫局,福建三明 365000; 2.宁德出入境检验检疫局,福建宁德 352000)



唐庆强1,陈泽宇1,陈舒奕2,张信仁1,程立军1,张云1

(1.三明出入境检验检疫局,福建三明 365000; 2.宁德出入境检验检疫局,福建宁德 352000)

采用高效液相色谱(HPLC)和电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)联用测定香菇及香菇培养料中亚砷酸盐As(Ⅲ)、砷酸盐As(Ⅴ)、一甲基砷酸盐(MMA)、二甲基砷酸盐(DMA)和砷甜菜碱(AsB)等5种砷元素化合物。样品经70 ℃超声萃取,阴离子色谱柱分离,ICP-MS检测,5种不同形态的砷分离效果良好,线性范围0～100.0 ng/mL,相关系数在0.9999以上,加标回收率81.0%～108.9%之间,相对偏差1.6%～6.3%(n=6)。用实际样品检测,培养料中的砷元素主要以As(V)的形式存在,其含量与栽培时间关系不大。鲜香菇和干香菇中则含有较多的As(Ⅲ)、As(Ⅴ)和AsB,虽然总砷结果符合国标限量要求,但高毒的无机砷占大多数。

高效液相色谱联用电感耦合等离子体质谱(HPLC-ICP-MS)，香菇，培养料，砷，形态分析

香菇是一种味道鲜美且富含香菇多糖、香菇嘌呤、核酸、麦角甾醇等生理活性成分的食用菌。研究表明,经常食用香菇能够增加人体免疫力,还具有防癌抗癌、降低血压和胆固醇的作用[1]。种植香菇的栽培基质主要是木屑、棉籽壳、玉米芯、秸杆、麦麸等农林副产品,同时需要加入一定量的石灰、石膏、过磷酸钙等添加剂,木本植物对重金属有一定的吸收积累、转化作用,使其不能短期释放到环境中。有研究表明,香菇在生长过程中会转化和富集培养基中的重金属[2]。近年来关于香菇中检出砷元素的报道不断增加,如王玥龙[3]测定了大庆地区的鲜香菇中的砷,其总砷含量范围为0.150～0.445 mg/kg,高于黑木耳、干黄蘑和干榛蘑。郑伟华等[4]测定了乌鲁木齐地区多种食用菌中的砷,含量范围为4.6×10-4～0.42 mg/kg,检出率为100%。胡桂仙等[5]测定了浙江省香菇中的砷,干制香菇中总砷的含量范围为0.150～0.950 mg/kg,同时测定的黑木耳和银耳。

砷的化合物形态主要包括有机砷和无机砷两大类,无机砷包括亚砷酸盐(As(Ⅲ))和砷酸盐(As(Ⅴ)),有机砷包括一甲基砷酸盐(MMA)、二甲基砷酸盐(DMA)、砷甜菜碱(AsB)、砷胆碱和砷糖等[6]。不同形态的砷毒性差异很大,砷糖、砷甜菜碱等有机砷几乎没有毒性,而无机砷的毒性却很高。国际癌症研究中心已将无机砷及其化合物确认为I级致癌物质,并将一甲基砷(MMA)和二甲基砷(DMA)列为潜在的致癌物质[7-8]。

目前国内外常采用高效液相色谱(HPLC)联用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)[9-10]、原子荧光光谱(AFS)[11-12]等方法分析不同形态的砷化合物。液相色谱联用氢化物发生-原子荧光法(HPLC-AFS)虽然较为常用,但分析结果最全面可靠的是液相色谱串联有机质谱法(HPLC-ICP-MS)[13]。本实验结合国内外文献报道,探讨使用高效液相色谱联用电感耦合等离子体质谱法,检测香菇及其培养料中多种砷形态。

1 材料与方法

1.1材料与仪器

Altus A-10型高效液相色谱仪 美国PerkinElmer公司;NexION 300D型电感耦合等离子体质谱仪 美国PerkinElmer公司;3-18K高速离心机 德国Sigma公司;VERSASTAR型酸度计 美国Thermo公司;M S 3D S25型涡旋仪 德国IKA公司。

1.2液相色谱及ICP-MS条件

色谱柱:Dionex IonPac AS19(250 mm×4.0 mm)阴离子交换柱;Dionex IonPac AS19(50 mm×4.0 mm)阴离子保护柱;流动相:A相(10 mmol/L乙酸钠,3 mmol/L硝酸钾,2 mmol/L磷酸二氢钠,0.2 mmol/L乙二胺四乙酸铁钠(EDTA),用氨水调节pH至10.7),B相(无水乙醇):A+B=99+1。流速:1.0 mL/min;进样量:50 μL;ICP-MS功率:1350 W;高纯氩气为载气;泵速20 r/min;驻留时间:1000 ms;采集质量数m/z=75;采集模式:标准模式。

1.3样品处理

称取4.0 g香菇或香菇培养料,加入38 mL纯水,涡旋混匀后,在70 ℃水浴中超声提取40 min,加入2 mL 3%乙酸溶液沉淀蛋白,于冰箱中4 ℃静置10 min,于4 ℃高速离心机中以18000 r/min离心5 min,取上清液过0.22 μm水系滤膜后上机测定。

1.4数据处理

用Empower3软件处理检测结果和数据,外标法定量。

2 结果与讨论

2.1流动相选择

文献中有使用碳酸铵[14]、磷酸氢二铵+硝酸铵[15]、碳酸钠+乙酸钠[16]等作为流动相,考虑到砷的化合物多是以离子形式存在,并且常用磷酸盐作为阴离子淋洗液,故选用磷酸二氢钠作为流动相,乙酸钠能改善AsB、DMA和As(Ⅲ)的分离度,并加入EDTA保护阴离子色谱柱。香菇培养料主要包括杂木、石膏等物质,含有较高的氯化物,加入硝酸钾能改变氯离子的出峰时间,避免对As造成干扰。同时,有文献记载[17]加入乙醇后测试的灵敏度可增高,因此在流动相中加入1%的乙醇,并调节pH改变各种形态砷在阴离子柱上的保留时间来达到良好的分离效果。通过对以上影响因素的分析并参考相关文献[18-19],选取2 mmol/L磷酸二氢钠+0.2 mmol/L乙二胺四乙酸铁钠+10 mmol/L乙酸钠+3 mmol/L硝酸钾+1%乙醇为流动相,调节pH=10.7。图1为选用该流动相的5种形态砷标准品(2.5 μg/L)的色谱图,从图1中可见,5种形态砷的分离度均大于1.5,保留时间在11 min之内。

图1 5种形态砷标准溶液色谱图Fig.1 Chromatogram of five arsenic species

2.2提取条件的优化

文献中对形态砷的提取有采用酸、水、甲醇-水和其他溶剂的,提取方式则包括湿法消解法、微波消解法、水浴提取法和超声萃取法等[6-14],研究表明,单独进行无机砷测定时常使用浓硝酸等强酸消化富集,要测定更多不同形态砷化合物时大多采用甲醇-水作为提取液,但甲醇虽然对有机砷的提取有益,但也会抑制无机砷的萃取效率。陈晞[15]等对比了盐酸提取、沸水提取和超声提取3种处理方式,刘崴[19]等研究了60、70、95和150 ℃下的不同提取条件,结果表明,酸提取会造成基线漂移和极宽的干扰峰,沸水提取回收率较低,60～70 ℃为较理想的提取温度,因此,本实验使用70 ℃条件下超声萃取的提取方式,采用加标回收测试的结果表明,该提取条件下方法回收率在81.0%～108.9%,提取效果较为理想。

2.3 ICP-MS条件优化

检测前,使用1.0 mg/L的Be、Mg、In、U、Ce混合调谐液对ICP-MS进行调谐,调整载气流速、采样深度、炬管位置、透镜参数等至最佳状态,使调谐后的仪器灵敏度达到中质量数(In114.904)≥40000,同时氧化物CeO/Ce<3%,双电荷产率Ce2+/Ce+<3%。

2.4线性范围和检出限

对浓度分别为0.0、2.5、5.0、10.0、50.0、100.0 ng/mL的5种形态砷混合标准溶液进样分析,以峰面积对浓度计算线性回归。结果表明,在该浓度范围内,5种形态砷线性范围良好,线性相关系数r>0.9999。对标准溶液进行逐级稀释,以信噪比(S/N)为10∶1时所对应的浓度及样品前处理最大稀释倍数计算定量检测限,结果见表1。

表1 5种形态砷的线性回归方程及相关系数Table 1 Linear regression equations and correlation coefficients of 5 arsenic species

2.5回收率与精密度

在干香菇、鲜香菇样品和香菇培养料样品上进行加标回收率实验,根据称样量分别加入相当于10.0、20.0和30.0 μg/kg质量浓度的形态砷标准溶液,按本文方法测定,重复进样6次,扣除样品空白后计算回收率和精密度,结果见表2。方法的回收率在81.0%～108.9%,精密度在1.6%～6.3%之间。

2.6实际样品检测

图2 培养料样品(a)、鲜香菇样品(b)和干香菇样品(c)的HPLC-ICP-MS色谱图Fig.2 HPLC-ICP-MS chromatograms of the culture medium sample(a),fresh Lentinus edodes sample(b) and dried Lentinus edodes sample(c)

从香菇种植基地选取接种2、60、99 d的香菇培养料和从市场上购买的3批鲜香菇、5批干香菇样品,按所建立的检测方法考察其中的形态砷分布情况,分析结果的色谱图如图2所示。在干香菇和鲜香菇中均检出了5种形态砷化合物,但MMA含量较低,在香菇培养料中检出As(Ⅴ),并检出少量As(Ⅲ)和AsB,测定结果见表3。结果表明,培养料中的砷元素主要以As(Ⅴ)的形式存在,鲜香菇和干香菇中则含有较多的As(Ⅲ)、As(Ⅴ)和AsB,而无论在培养料还是香菇中,MMA检出率都最低,表明香菇及培养料中的MMA不稳定或易被分解。从砷元素的分布情况来看,培养料中只检出As(Ⅴ),而接种后栽培时间的延长对其含量影响不大。干香菇中含量最高的砷化合物是As(Ⅲ),其次是AsB,分别占到全部形态砷元素的42.0%～57.0%和15.5%～26.8%。鲜香菇中含量最高的分别是As(Ⅲ)和As(Ⅴ),占比达到全部形态砷元素的32.0%～38.2%和25.4%～37.2%。从检测结果来看,虽然干香菇和鲜香菇样品中的砷元素检测结果满足GB 2762-2012[20]标准中总砷小于0.5 mg/kg(食用菌及其制品)和GB 7096-2003[21]中干食用菌总砷小于1.0 mg/kg，鲜食用菌总砷小于0.5 mg/kg的限量要求,但高毒无机砷的含量整体高于低毒的有机砷,在食品安全上也应引起关注。

表3 实际样品检测结果(μg/kg)Table 3 Analytical results of samples(μg/kg)

注:LOQ:定量检测限。

3 结论

香菇及香菇培养料经热水结合超声波提取后,采取液相色谱分离,并利用电感耦合等离子体质谱测定5种形态砷元素的含量。结果表明,该方法准确高效,准确度和精度均满足检测需要。实际样品中,培养料中的砷元素主要以As(V)的形式存在,其含量与栽培时间关系不大。鲜香菇和干香菇中则含有较多的As(Ⅲ)、As(Ⅴ)和AsB,虽然总砷结果符合国标限量要求,但高毒的无机砷占大多数。

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SpeciesanalysisofarsenicinLentinusedodesandculturemediumbyHPLC-ICP-MS

TANGQing-qiang1,CHENZe-yu1,CHENShu-yi2,ZHANGXin-ren1,CHENGLi-jun1,ZHANGYun1

(1.Sanming Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Sanming 365000,China; 2.Ningde Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Ningde 352000,China)

The method for determination of arsenite(As(Ⅲ)),arsenate(As(Ⅴ)),methylarsonic acid(MMA),dimethylarsinic acid(DMA),and arsenic betaine(AsB)arsenic species inLentinusedodesand culture medium by HPLC-ICP-MS has been developed.Samples were extracted with ultrasonic instrument in 70 ℃,then separated by HPLC on an anion chromatography and quantification by ICP-MS. Good linearities of 5 arsenic species were observed with correlation coefficients above 0.9999,the linear range was 0～100.0 ng/mL.Recoveries were between 81.0% and 108.9% and the relative standard deviation were within 1.6%～6.3%(n=6).With the actual samples tested the As(V)was the main species in culture medium.The content had little relation with its cultivation time.It had more content As(Ⅲ),As(Ⅴ)and AsB inLentinusedodes. Although the total arsenic results conform to the requirements of the national standards,but high toxic inorganic arsenic are majority.

HPLC-ICP-MS;Lentinusedodes;culture medium;arsenic;species analysis

2016-11-30

唐庆强(1981-)，男，硕士，工程师，研究方向：食品检测技术与应用，E-mail:tqqls@163.com。

福建出入境检验检疫局科技计划(FK2013-27)。

TS207.3

:A

:1002-0306(2017)12-0017-04

10.13386/j.issn1002-0306.2017.12.003