JNK通路参与Aβ1-40诱导的海马神经干细胞凋亡过程①

王国辉，王丽华，秦丽红，王 璇，高凤荣，王昆祥

(佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯 154003)

JNK通路参与Aβ1-40诱导的海马神经干细胞凋亡过程①

王国辉，王丽华，秦丽红，王 璇，高凤荣，王昆祥

(佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯 154003)

目的：探讨在Aβ1-40诱导的海马神经干细胞凋亡过程中JNK通路的作用。方法：应用Westernblot技术检测Aβ1-40(5μM)慢性孵育12h、24h和48h对海马神经干细胞JNK磷酸化水平的影响；在Aβ1-40(5μM)孵育前30min加入JNK阻断剂SP600125(10μM)共同孵育12h、24h和48h，应用Hoehest33342染色和MTT法检测SP600125与Aβ1-40联合作用后对神经干细胞凋亡的影响。结果：在不同时间点，JNK磷酸化水平均增加，24h表达最显著(P<0.01)；给予SP600125后可使Aβ1-40诱导的神经干细胞死亡明显减轻。结论：Aβ1-40激活JNK通路后促进了海马神经干细胞凋亡。

Aβ1-40；JNK；凋亡

c-Jun氨基末端激酶(c-JunN-terminalkinase,JNK)属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase,MAPK)超家族的成员之一。JNK通路常存在于多种生命过程中，如细胞分化和细胞死亡等[1]，是一条与细胞凋亡相关的重要信号转导途径。有文献报道，JNK通路可被多种凋亡刺激因素所激活，而且当JNK活性降低或JNK通路被抑制时，可在一定程度上对神经细胞的死亡起到保护作用[2]。而大量研究证实，阿尔茨海默病(Alzheimer’sdisease,AD)是由β-淀粉样多肽(Aβ)聚集诱导神经细胞损伤甚至凋亡所致[3,4]。因此，对JNK通路的研究有助于为揭示AD的发病机制提供依据。本实验以Aβ1-40和SP600125为施加因素，观察JNK通路在Aβ1-40诱导的神经干细胞凋亡中的作用，为探究AD的发病机制提供理论及实验依据。

1 实验材料与方法

1.1 实验动物

健康Sprague-Dawley(SD)大鼠(<72h)，雌雄均可，购于佳木斯大学实验动物中心。

1.2 主要实验药品

Aβ1-40购于Biosouxee公司，MTT、Hoechst33342、TEA购于Sigma公司。

1.3 实验方法

1.3.1Westernblot技术

将细胞经裂解液处理后提取蛋白样品，取50μg蛋白样品上样，进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后进行转膜，转膜结束后封闭1h，一抗孵育并4℃过夜，TBS-T溶液洗膜后孵育二抗1h，TBS-T溶液洗膜后进行ECL显影，扫片及数据处理分析。

1.3.2MTT法

在神经干细胞中加入20μL的MTT溶液(5mg/mL)，置37℃培养4h，吸去培养液后加入150μL二甲基亚砜(DMSO)，低速振荡10min，酶标仪OD570nm处检测各孔吸光值。

1.3.3Hoechst33342法

在细胞中加入4%多聚甲醛，与培养液以1：3混合，固定细胞10min。去除固定液，在各组细胞中加入Hoechst33342，37℃孵育15min。吸除染色液并洗涤后，直接在荧光显微镜下观察结果。

2 结果

2.1Aβ1-40慢性孵育对海马神经干细胞JNK磷酸化水平的影响

Aβ1-40(5μM)慢性孵育12h、24h和48h后，应用Westernblot技术检测Aβ1-40对海马神经干细胞中JNK的影响。结果显示，在不同时间点，JNK磷酸化水平均增加，24h表达最显著(n=3，P<0.05)。见图1。

图1 Aβ1-40慢性孵育对海马神经干细胞JNK磷酸化水平的影响

*P<0.05

2.2SP600125与Aβ1-40联合作用对海马神经干细胞凋亡的影响

在Aβ1-40(5μM)孵育前30min加入SP600125(10μM)，与Aβ1-40共同孵育12h、24h和48h，应用MTT法观察其对海马神经干细胞存活率的影响。结果显示，SP600125可明显减轻Aβ1-40诱导的神经干细胞死亡，使细胞存活率明显升高(P<0.01)。见图2。

图2 SP600125与Aβ1-40联合作用对海马神经干细胞存活率的影响

(与对照组相比#P<0.01；与Aβ1-40组相比*P<0.01)

在Aβ1-40(5μM)孵育前30min加入SP600125(10μM)，与Aβ1-40共同孵育48h，应用Hoehest33342染色观察其对海马神经干细胞凋亡发生率的影响。结果显示，SP600125可明显降低Aβ1-40所引起的细胞凋亡发生率，由(18.2±1.7)%降至(8.1±06)%(P<0.01)。

3 讨论

AD是一种与衰老相关并以记忆和认知功能障碍为主要特征的退行性脑病，其主要病理特征为新皮层、海马等处出现Aβ沉积形成的高度老年斑、神经纤维缠结和大量神经元的减少等[5]。其中，Aβ沉积形成老年斑进而导致神经细胞损伤甚至凋亡是AD发病的核心因素，因此，探究Aβ导致神经细胞凋亡的过程是非常有必要的，它可为明确Aβ的毒性作用机制提供依据。近年来有大量相关文献报导，JNK通路是一条与神经细胞凋亡相关的常见信号转导通路[6,7]，因此，可以做进一步研究以明确JNK通路是否参与了Aβ导致的神经细胞凋亡过程，这对于揭示AD的发病机制有重要意义。本实验以Aβ1-40和SP600125为施加因素，观察了SP600125在Aβ1-40所

诱导的海马神经干细胞凋亡中的作用，结果显示，Aβ1-40可增加JNK磷酸化水平的蛋白表达；给予SP600125后可使Aβ1-40诱导的神经干细胞死亡明显减轻。这些结果表明，JNK通路的激活参与了Aβ1-40诱导的海马神经干细胞凋亡过程，即，Aβ1-40激活JNK通路后引起了海马神经干细胞的凋亡。在前期工作中发现延迟整流钾通道也参与了Aβ1-40诱导的海马神经干细胞凋亡过程，那么，JNK通路与延迟整流钾通道在Aβ1-40诱导的海马神经干细胞凋亡过程是否存在一定的联系呢？在今后的实验中可进一步研究，以更加明确Aβ1-40诱导的细胞凋亡过程的机制。

[1]IpYT,DavisRJ.Signaltransductionbythec-JunN-terminalkinase(JNK)-frominflammationtodevelopment[J].CurrOpinCellBiol, 1998, 10:205-219

[2]CarolMTroy,SylviaARabacchi,ZhihengXu,etal.β-Amyloid-inducedneuronalapoptosisrequiresc-JunN-terminalkinaseactivation[J].J-Neurochem, 2001, 77(1):157-164

[3]田嘉莹，盛宝英，齐志国.β1-40致伤的神经干细胞的存活率及Caspase-3的活性变化[J].黑龙江医药科学，2013，36(1)：111-112

[4]张金波，王淑秋，张虎，等.灵芝孢子粉对戊四氮活化海马神经细胞bcl-2表达的研究[J].黑龙江医药科学，2012，35(4)：34-35

[5]VillafloresOB,ChenYJ,ChenCP,etal.Curcuminoidsandresveratrolasanti-Alzheimeragents[J].Taiwanesejournalofobstetrics&gynecology, 2012,51(4):515-525

[6]DonnaBozyczko-Coyne,TeresaMO’Kane,Zhi-LiangWu,etal.CEP-1347/KT- 7515,aninhibitorofSAPK/JNKpathwayactivation,promotessurvivalandblocksmultipleeventsassociatedwithAβ-inducedcorticalneuronapoptosis[J].JournalofNeurochemistry, 2001, 77:849-863

[7]栾倩，刘蕾，刘君星，等.灵芝酸对痫样放电海马神经元ERK1/2磷酸化水平的影响[J].黑龙江医药科学，2014，37(2)：1-3

黑龙江省教育厅科学技术研究项目，编号：12521569。

王国辉(1971～)男，黑龙江佳木斯人，硕士，副主任医师。

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1008-0104(2017)03-0008-02

2017-03-18)