PCDH10基因在结直肠癌组织中的表达①

姜文强，陈玉强，王彤旭，吕 鑫，王亚洲

(佳木斯大学临床医学院，黑龙江 佳木斯 154003)

PCDH10基因在结直肠癌组织中的表达①

姜文强，陈玉强，王彤旭，吕 鑫，王亚洲

(佳木斯大学临床医学院，黑龙江 佳木斯 154003)

目的：检测结直肠癌组织及对应的癌旁正常组织中PCDH10基因表达mRNA水平及其启动子区域甲基化状态，探究该基因在结直肠癌发生发展中的作用。方法：选取2016-01～2017-02于佳木斯大学附属第一医院普外科直接行手术切除治疗的60例结直肠癌患者的肿瘤组织及对应的癌旁正常组织，采用甲基化PCR (MSP)和RT-PCR实验技术，检测两者组织中PCDH 10基因启动子甲基化状态和mRNA水平情况，并根据临床资料进行分析。结果：PCDH10基因在结直肠癌组织中见启动子明显异常甲基化，比例为53.3%(32/60)，远高于癌旁组织8.3%(5/60)，二者差异具有显著统计学意义(P<0.01)；在结直肠癌组织中其mRNA表达只有8.3%(5/60)，大多数表达沉默，而在癌旁组织中高表达90%(54/60)，二者差异具有统计学意义(P<0.05)；PCDH10基因异常甲基化与结直肠癌患者性别、年龄、肿瘤大小未见相关(P>0.05)，与Dukes分期、分化程度、淋巴结转移密切相关(P<0.05)。结论：PCDH10基因在结直肠癌组织中表达大多数沉默，但其启动子异常甲基化显著，说明该基因可能在结直肠癌的发生、发展中具有抑制作用。

结直肠癌；PCDH10；甲基化；mRNA表达

在我国结直肠癌的发病率为9.2-17.0/10万，并且有逐年上升趋势，发病人群也有年轻化趋势，因此结直肠癌一直在我国消化道肿瘤研究领域中，是重点研究的恶性肿瘤之一[1]。PCDH10基因是新近发现的原钙黏蛋白基因，其编码蛋白参与细胞分化、细胞间黏附及信息传递等重要功能[2，3]。近年来，多项研究表明，PCDH10基因启动子异常甲基化和表达异常，发生在宫颈癌、鼻咽癌、乳腺癌、多发性骨髓瘤、肝癌等多种恶性肿瘤中，说明该基因对抑制肿瘤生长、迁移、浸润及转移有密切的关系[4]。本研究检测结直肠癌组织及对应癌旁正常组织中PCDH10基因启动子甲基化状态和mRNA水平情况，并根据临床资料进行分析，探讨PCDH10基因在结直肠癌的发生及进展中的作用，为最终可能成为新的治疗手段和抗肿瘤药物的研发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 标本来源

取自2016-01～2017-02于佳木斯大学附属第一医院普外科，直接行手术切除治疗而未行任何辅助治疗的患者60例。其中男36例，女24例；年龄38～80岁，中位年龄60.5岁；结肠癌39例，直肠癌21例；肿瘤直径>4cm28例，≤4cm32例；高中分化37例，低分化23例；Dukes分期A+B期45例，C+D期15例；有淋巴转移16例，未见淋巴转移44例。从手术室获取组织标本后，保存在液氮罐中，登记编号后置于-80℃冰箱中储存，用于提取相关实验材料。手术切除的肿物经病理科诊断证实为结直肠癌组织(腺癌)；对照组为手术切除配对的癌旁组织(距肿瘤切缘5cm以上)，并在病理科诊断证实为良性组织。本实验中所有患者均已知情同意，并且经过佳木斯大学附属第一医院伦理道德委员会批准同意。

1.2 实验方法

1.2.1 染色体DNA提取：按照DNA提取试剂盒(QIAGEN公司，德国)及DNA甲基化试剂盒(QIAGEN公司，德国)说明书操作步骤分别进行DNA提取及亚硫酸氢钠修饰，每次进行修饰的DNA量为1μg，经过修饰的DNA立即进行MSP检测，或置于-80℃冰箱中保存备用。

1.2.2MSP检测PCDH10基因启动子甲基化状态：引物参照文献[4]中的序列，由上海生工生物工程有限公司合成,甲基化上游引物序列为5'-TCGTTAAATAGATACGTTACGC-3'；下游引物序列为5'-TAAAAACTAAAAACTTTCCGCG-3'；非甲基化上游引物序列为5’-GTTGTTAAATAGATATGTTATGT-3'；下游引物序列为5'-CTAAAAACTAAAAACTTTCCACA-3’。MSP反应体系为25μL， 反应条件为：95℃预变性10min；94℃变性30s，甲基化引物退火60℃(非甲基化引物退火58℃) 30s,72℃延伸30s，一共40个循环，最后72℃延伸5min。无菌去离子水作为空自对照。

1.2.3 从组织标本中提取总RNA：按照Trizol试剂(InvitrogenLifeTechnologies，Carlsbad，CA，USA)提取组织标本RNA，采用Fermentas(美国)的DNA提取试剂盒合成cDNA，转录所得的cDNA储存于-20℃作为模板用于半定量RT-PCR。

1.2.4 采用RT-PCR：PCR反应体系为25μL，按照试剂盒(QIAGEN，德国)的要求所有操作都在冰上进行以基因组DNA为模板的PCR反应体系及反应条件如下:1)反应体系：模板基因组DNA1μL,Hotstart聚合酶0.125μL、10UmPCDH10上下游引物各0.75μL、10UmGAPDH上下游引物各0.5μL、dNTP(10Mm) 0.5μL、10xreactionbuffer2.5μL、Q-SOLUTION5μL、ddH20 13.5μL。2)反应条件：95℃预变性15min；95℃ 30s，53℃ 30s，72℃ 40s，10个循环；95℃ 30s，52℃ 30s， 72℃ 40s， 24个循环；72℃ 10min。最后1.5%的琼脂糖检测PCR产物大小，凝胶成像分析仪成像。

1.3 统计学方法

采用SPSS17.0软件，采用卡方检验方法进行，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1PCDH10甲基化情况

在结直肠癌组织中，PCDH10基因明显异常甲基化，比例为53.3%(32/60)，远高于癌旁组织8.3%(5/60)，二者差异具有显著统计学意义(P<0.01)。见表1。

2.2PCDH10基因mRNA水平表达

PCDH10癌旁组织中高表达90%(54/60)；在绝大多数结直肠癌组织中mRNA表达沉默，二者差异具有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表1 结直肠癌组织和癌旁组织中的PCDH10基因甲基化水平

表2 结直肠癌组织和癌旁组织中的PCDH10基因mRNA水平

2.3 甲基化情况水平与患者临床病理特征

PCDH10基因异常甲基化与结直肠癌患者的性别、年龄、肿瘤大小未见相关(P>0.05)，但与Dukes分期、分化程度、淋巴结转移密切相关(P<0.05)，见表3。

表3 PCDH10在原发结直肠癌组织中的甲基化情况水平与患者临床病理特征的相关性分析

3 讨论

随着对肿瘤的成因及致病机制不断深入研究发现，表观遗传学异常是肿瘤形成的重要机制，其中较深入研究是DNA甲基化[5]。大量研究表明,DNA甲基化能引起染色质结构、DNA稳定性、DNA构象及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制表达[6～8]。PCDH10基因(又称为OL-protocadherin和KIAA1400)，位于染色体4q28.3，长约42.26kb。早期对PCDH10研究主要集中在神经系统方面，认为其异常表达可以影响神经元活性，是自闭症相关基因；近来有研究表明其异常表达可以抑制肿瘤细胞生长、迁移、浸润和集落形成[9]。本研究中，结直肠癌患者肿瘤组织中，PCDH10基因明显异常甲基化高于癌旁正常组织；而癌旁正常组织中PCDH10高表达远高于结直肠癌组织，表明该基因异常甲基化及表达沉默可能参与结直肠癌发生；PCDH10基因异常甲基化与患者临床分期、分化程度、淋巴结转移密切相关，提示该基因甲基化在结直肠癌恶性进展中有影响。综上所述，PCDH10基因在结直肠癌发生发展中具有重要作用，这对进一步研究结直肠癌的发病机制、临床治疗有着重要意义，最终可能成为新的治疗手段和抗肿瘤药物的研发提供理论依据。

[1]包合新，李建国，邢桂滨.EZH2和Bmi-1 基因在结直肠癌组织中的表达及其意义[J].黑龙江医药科学，2014，37(1)：10-12

[2] 王星权，王亚洲，陈玉强，等.Smad-4 在结直肠癌的表达及评价患者预后的研究[J].黑龙江医药科学，2015，38(6)：77-80

[3]ZhongX，ZhuY，MaoJ，etal.FrequentepigeneticsilencingofPCDH10bymethylationinhumancolorectalcancer[J].JCancerResClinOncol，2013,139(3)：485

[4]MaJG，HeZK，MaJH，etal.Downregulationofprotocadhcrin-10expressioncorrelateswithmxlitgnantbehaviourandpoorprognosisinhumanbladdercancer[J].JIntMedRes,2013，41 (1)：38

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[6]NolletF，KoolsP，vanRoyF.Phylogeneticanalysisofthecadherinsuperfamilyallowsidentification'ofsixmajorsubfamiliesbesidesseveralsolitarymembers[J].JMolBiol2000，299：551-728

[7]YuJ，ChengYY，TaoQ，etal.Methylationofprotocadherin10，anoveltumorsuppressor，isassociatedwithpoorprognosisinpatientswithgastriccancer[J].Gastroenterology，2009，136(2)：640-651

[8]El-OstaA，WolffeAP.DNAmethylationandhistonedeacetylationinthecontrolofgeneexpression:basicbiochemistrytohumandevelopmentanddisease[J].GeneExpr,2000,9(1-2)：63-75

[9]LiZ，ChimJC，YangM，etal.RoleofPCDH10anditshypermethylationinhumangastriccancar[J].BiochimBiophysActa,2012，1823(2)：298

佳木斯大学研究生科技创新项目，编号：YM2016_043。

姜文强(1990～)男，黑龙江绥化人，在读硕士研究生，医师。

陈玉强(1969～)男，黑龙江佳木斯人，博士，主任医师，教授，硕士研究生导师。E- mail: 522712134@qq.com。

R735.3+5；R735.3+

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1008-0104(2017)03-0104-02

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