斑马鱼胚胎急性毒性实验法检测赶山鞭化学成分胚胎发育毒副作用

吴梦华,董建勇*

（1.浙江大学医学院附属儿童医院,浙江 杭州 310000;2.温州医科大学,浙江 温州 325000）

斑马鱼胚胎急性毒性实验法检测赶山鞭化学成分胚胎发育毒副作用

吴梦华1,董建勇2*

（1.浙江大学医学院附属儿童医院,浙江 杭州 310000;2.温州医科大学,浙江 温州 325000）

目的 利用斑马鱼胚胎急性毒性实验检测赶山鞭化学成分胚胎发育毒副作用。方法 以孵育6 h的斑马鱼胚胎为实验模型，设DMSO对照组和quercetin,rutin,hyperin,quercertin-3-O-α-L-arabinofuranoside,quercertin-3-O-β-D-glucoside五种赶山鞭单体化合物样品组，观察记录72 hpf（受精后72小时）时的致死率、致畸率、孵化率。结果 72 hpf,在各浓度梯度范围内，5种化合物对斑马鱼胚胎致死致畸抑制孵化效应明显（P＜0.05），高浓度时愈加明显（P＜0.01），且呈现一定的剂量依赖效应。畸形类型主要为心房囊水肿、体节弯曲。结论 上述5种化合物可能对胚胎发育有一定的毒性。

赶山鞭;斑马鱼胚胎;急性毒性

赶山鞭系藤黄科金丝桃属植物Hypericum attenuatum的全草。该属植物在我国分布广泛，有抑制血管、抗抑郁、抗病毒等药理作用[1]，有光敏性皮炎、眩晕、疲乏等毒副作用[1]。关于该属植物的有效活性成分研究较多，但是关于其导致毒副作用的化学成分研究较少。传统毒理学研究多数是以小鼠为模型评估药物毒性[2]，但成本高、周期长、结果不易观察。近年来，因斑马鱼与人类各器官系统极其相似[3]、周期短、胚胎透明易观察、对毒性物质反应灵敏[4]等优点，逐渐作为新模型应用于药物毒性评价[5],本文通过对斑马鱼胚胎的急性毒性观察，初步检测赶山鞭导致胚胎发育毒副作用的化学成分。

1 材料与方法

1.1 实验动物

斑马鱼（无病原体AB品系，由美国Oregon州立大学提供）,饲养在专用的循环系统中，水温28℃，鱼室光周期设定为14 h光/10 h暗。早晚各一次饲喂丰年虫（Artemien,Salina），中午辅以商品鱼饲料。实验前挑选健康性成熟的斑马鱼放入孵化箱中，每个孵化罐中的雌雄比例保持为2∶1，次日亮灯后半个小时即可收集胚胎。使用系统水将胚胎冲洗干净，弃掉成鱼粪便等杂质，以及未受精和发育不良的胚胎（呈白色不透明状）。将剩余胚胎置于培养皿中加入胚胎培养液，放入28℃、光周期14 h光/10 h暗的光照培养箱中培养。

1.2 药品与试剂

赶山鞭（甘肃宕昌县，样本保存在浙南特色中药重点实验室）；quercetin(化合物1),rutin(化合物2),hyperin(化合物 3),quercertin-3-O-α-L-arabinofuranoside(化合物 4),quercertin-3-O-β-D-glucoside(化合物5)（均从赶山鞭中分离得到，经温州医科大学药学院董建勇教授鉴定）。

胚胎 培 养 液 （称 取 0.8 g NaCl、0.04 g KCl、0.003 58 g Na2HPO4、0.006 g KH2PO4、0.144 g Ca-Cl2、0.246 g MgSO4·7H2O、0.35 g NaHCO3·800 mL超纯水置于1 L烧杯中，搅拌至完全溶解，再用超纯水定容至1 L,滴加1 M NaOH调pH至7.2）。化合物母液配制见表1。

表1化合物母液配制及浓度

1.3 主要仪器

全封闭斑马鱼循环系统（AHAB），体式显微镜（Nikon SMZ 1500），光照恒温培养箱（RXZ智能型，宁波江南仪器厂）。

1.4 胚胎急性毒性实验[6]

通过预实验设定浓度梯度：化合物1～2为0、1、2、4、8、16 μg/μL;化合物 3～5 为：0、1、2、4、8、16、32 μg/μL。同时设DMSO对照组。配制化合物工作液：取最高浓度化合物母液，边振荡边加入胚胎培养液中，稀释1 000倍，配制成最高浓度工作液，溶液中DMSO浓度为0.1%；低浓度工作液用高浓度工作液逐级稀释。将DMSO边振荡边加入胚胎培养液中，配制含0.1%DMSO的对照溶液。各溶液于实验前现配现用。挑选胚胎：收集胚胎6 h左右，在体式显微镜下从收集到的胚胎中挑选发育正常、已进入半包期的受精胚胎。暴毒：取96孔培养板，DMSO组每孔加入200 μL胚胎培养液，占16个孔。各实验组分别加入200 μL不同浓度的工作液，每个浓度的溶液均占16个孔，将挑选出来的胚胎随机放入96孔培养板中，每孔1枚胚胎。将培养板放回光照培养箱培养，不能叠放，以防各组胚胎发育不均衡。实验重复3次。观察：分别在胚胎受精后24、48、72、96 h时，于体式显微镜下进行观察、记录各组胚胎孵化、畸形、死亡等状况，并使用CCD拍照。畸形：心房囊水肿，卵黄囊水肿，下颌异常，体节异常，尾部形态异常，黑色素细胞形成异常，心跳缓慢，活动能力差等与正常斑马鱼明显不同的发育状态。死亡：15 s内没有观察到心跳，即判定为死亡。孵化率=（胚胎孵化数/胚胎原数）×100%;死亡率=1-（胚胎死亡个数/胚胎原数）×100%;畸形率=（胚胎畸形个数/胚胎原数）×100%+死亡率。

1.5 统计学分析[6]

使用SPSS 22.0软件通过one-way ANOVA对不同处理组数据进行统计分析，以P＜0.05为差异有统计学意义，使用origin 8.0软件进行非线性拟合计算LC50值。

2 结果

2.1 各化合物对斑马鱼胚胎生长发育的影响

选取胚胎受精72 hpf的实验结果进行分析,从图1结合表2可以看出：空白和DMSO对照组胚胎孵化、畸形和死亡率无差异（P＞0.05）。在浓度梯度范围内，五种化合物对斑马鱼胚胎致死致畸抑制孵化效应明显(P＜0.05)，随着浓度递增，致死致畸抑制孵化效应愈加明显（P＜0.01），呈现良好的剂量效应。

2.2 各个化合物的LC50值

化合物 1～5 LC50值大小分别为：4.14、6.07、15.08、13.61、13.37 μg/μL。

2.3 化合物的胚胎畸形类型

高浓度(8～16 μg/μL)样品对胚胎的 72 hpf致死率较高，畸形率主要来源于死亡率，存活下来的幼鱼中畸形个体少。低浓度(1～4 μg/μL)样品对胚胎致死率不高，存活下来的幼鱼畸形类型主要有心房囊水肿和体节弯曲，参见图2[7]。

图1化合物1～5对斑马鱼胚胎的致死率（mortality）、孵化率(hatch)、致畸率(malformation)

表2 5个化合物对斑马鱼胚胎的致死率(mor)、孵化率(hat)、致畸率(mal) （±s,n=3）

表2 5个化合物对斑马鱼胚胎的致死率(mor)、孵化率(hat)、致畸率(mal) （±s,n=3）

C(μg/μL)化合物1(%) 化合物2(%) 化合物3(%)mor hat mal mor hat mal mor hat mal 0 1 2 4 8 1 6 32 0.00±0.00 6.25±0.00*27.08±3.61**56.25±6.25**91.67±3.61**100.0±0.00**-100.00±0.00 91.67±3.61*85.42±3.61**79.17±3.61**43.75±6.25**33.33±3.61**-0.00±0.00 10.42±3.61**27.08±3.61**54.17±3.61**79.17±3.61**100.0±0.00**-0.00±0.00 16.67±3.61**31.25±6.25**43.75±6.25**58.33±3.61**100.0±0.00**-100.00±0.00 91.67±6.25 85.42±6.25*79.17±6.25**43.75±6.25**33.33±3.61**-0.00±0.00 10.42±3.61**27.08±3.61**54.17±12.5**79.17±3.61**100.0±0.00**-0.00±0.00 8.33±3.61*16.67±7.22**27.08±3.61**33.33±3.61**47.92±3.61**100.0±0.00**100.00±0.00 91.67±3.61**85.42±3.61**72.92±3.61**45.83±3.61**39.58±3.61**35.42±3.61**0.00±0.00 12.50±6.25**20.83±3.61**33.33±3.61**45.83±3.61**52.08±3.61**100.0±0.00**

续表2 5个化合物对斑马鱼胚胎的致死率(mor)、孵化率(hat)、致畸率(mal) （±s,n=3）

续表2 5个化合物对斑马鱼胚胎的致死率(mor)、孵化率(hat)、致畸率(mal) （±s,n=3）

注：与对照组比较：*P＜0.05,**P＜0.01。

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图2各化合物致AB品系斑马鱼胚胎72 hpf时的主要畸形表型

3 讨论

实验表明 hyperin 在高浓度(16 μg/μL)时，对斑马鱼胚胎基本致死致畸且显著抑制孵化 （P＜0.01），据文献报道，hyperin对胎鼠生长发育有一定影响，建议怀孕妇女慎用[8]。其它几种化合物均对斑马鱼胚胎致死致畸抑制孵化效应明显，建议怀孕妇女慎用。

据各化合物LC50，提示毒副作用：化合物3＜化合物4＜化合物5＜化合物2＜化合物1。畸形类型有心房囊水肿和脊柱弯曲，前者是心脏血管功能障碍引起[9]，斑马鱼心脏的发育需要细胞增殖、迁移、分化和不同起源的细胞之间的相互作用，与多种基因的表达有关[10]，具体作用机制待进一步研究；斑马鱼鱼体脊柱弯曲可能与胚胎sepn1基因表达有关[11]，机制待进一步研究。此5种化合物均为黄酮类化合物，提示黄酮类化合物可能是造成赶山鞭胚胎发育毒副作用的主要成分。

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（本文编辑 杨 瑛）

Toxic and Side Effects of Chemical Constituents from Hypericum attenuatum on Embryonic Development of Zebrafish

WU Menghua1,DONG Jianyong2*
(1.Children's Hospital Affiliated to Zhejiang University School of Medicine,Hangzhou,Zhejiang 310000,China;2.Wenzhou Medical University,Wengzhou,Zhejiang 325000,China)

Objective To detect the toxic and side effects of chemical components from Hypericum attenuatum on embryonic development of zebrafish by acute toxicity test.Methods The 6 h post-fertilization zebrafish was used as experimental models,randomly divided into the control group with DMSO and the sample groups with quercetin,rutin,hyperin,quercertin -3 -O -α -L -arabino furanoside, quercertin -3 -O -β -D -glucoside of Hypericum attenuatum.The mortality,malformation,hatchability at 72 hpf(72 hours after fertilization)were observed.Results The five constituents show obvious inhibiting hatchability on embryonic development of zebrafish(P＜0.05),which show stronger inhibition at high concentration,with dose-dependent effect.Conclusion The five components may have a certain toxicity to embryonic development.

Hypericum attenuatum;embryos of zebrafish;acute toxicity

R285.5；R994.39

A

doi：10.3969/j.issn.1674－070X.2017.06.006

本文引用：吴梦华,董建勇.斑马鱼胚胎急性毒性实验法检测赶山鞭化学成分胚胎发育毒副作用[J].湖南中医药大学学报，2017,37（6）：602-605.

2016-10-25

吴梦华，男，药师，硕士，研究方向：中药活性成分提取。

* 董建勇，男，教授，硕士研究生导师，E-mail：491195878@qq.com。