原发性PD患者SMPD1基因3、4号外显子突变及其临床意义

马艳，宋娜，牛建一，丁刚

(1 潍坊医学院，山东潍坊261042；2 聊城市人民医院；3 潍坊医学院附属益都中心医院)

原发性PD患者SMPD1基因3、4号外显子突变及其临床意义

马艳1，宋娜2，牛建一3，丁刚3

(1 潍坊医学院，山东潍坊261042；2 聊城市人民医院；3 潍坊医学院附属益都中心医院)

目的 探讨SMPD1基因3、4号外显子突变与原发性帕金森病(PD)的关系。方法 选择临床确诊的原发性PD患者103例(PD组)、体检健康者103例(对照组)，按照SMPD1基因序列和相关文献设计引物，采用PCR技术对SMPD1基因3、4号外显子进行扩增，并将PCR产物进行序列测序和突变分析。结果 经对测序结果序列比对发现，两组SMPD1基因存在p.A402T位点突变，均为杂合突变，即基因型为GA型。其中，PD组SMPD1基因p.A402T位点突变概率为11.65%(12/103)，对照组为0.97%(1/103)，两组比较P<0.01。生物信息学分析显示，该突变导致其编码的溶酶体酶SMase稳定性降低。Mutation Taster和PolyPhen2软件检测结果显示，SMPD1基因存在p.A402T位点致病性突变。结论 原发性PD患者SMPD1基因存在p.A402T位点突变，该位点突变可能增加PD的发病风险。

帕金森病；SMPD1基因；p.A402T突变

帕金森病(PD)又称震颤性麻痹，是一种仅次于阿尔茨海默病的常见神经退行性疾病，多见于60岁以上老年人。其临床症状主要表现为静止性震颤、行动迟缓、肌强直和姿势不稳[1]。现已证实，原发性PD(本研究以下称PD)的发病与某些基因突变有关。在德系犹太人群中LRRK2、GBA初始突变与PD的发病关系密切，而LRRK2基因p.G2019S和GBA初始突变的概率分别为15%、20%[2，3]。SMPD1基因突变最早报道能够引起一种常染色体隐性遗传性溶酶体贮积病——尼曼匹克病。最近研究发现，SMPD1基因突变可引起溶酶体功能丧失，导致体内的α突触核蛋白聚合和路易小体沉积，从而导致PD[4，5]。在犹太人群中，PD的发病与SMPD1基因p.L302P[4]、c.996delC(fsP330)[6]位点突变有关，特别是p.L302P位点，但在中国人群中并未发现p.L302P位点突变[5,7]；另有研究发现，在中国人群中SMPD1基因p.R591C位点突变和Leu-Ala(Val)重复变异与PD的发病有关[8,9]。以上研究提示，PD可能在不同区域、不同种族中具有遗传异质性。本研究分析103例PD患者SMPD1基因3、4号外显子突变情况，旨在为进一步寻找中国PD患者SMPD1基因外显子上可能的致病突变位点。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2015年6月～2016年6月聊城市人民医院和益都中心医院收治的PD患者103例(PD组)，其中，男67例、女36例，发病年龄50～78岁(66.5±11.39)岁。PD均为散发；其诊断符合英国BrainBank标准[10]：运动迟缓且至少具备肌强直、静止性震颤或姿势平衡障碍(并非由于原发的视觉、前庭、小脑或本体感觉造成)中的一项。排除继发性PD、帕金森叠加综合征和其他神经系统疾病，甲亢及其他遗传性疾病。同期另选与PD组性别、年龄匹配的体检健康者103例(对照组)，男67例、女36例，年龄(65.4±12.1)岁。两组性别、年龄具有可比性。本研究经过医院伦理委员会批准，患者均知情同意。

1.2 SMPD1基因3、4号外显子测序及突变分析

1.2.1 DNA提取 收集所有研究对象肘正中静脉血5 mL，置于含EDTA的抗凝管中，混匀，置于-80 ℃冰箱保存。采用血液基因组DNA提取试剂盒提取全血基因组DNA，然后将提取的DNA溶于50～100 μL无菌ddH2O中。NanoDrop2000超微量分光光度计检测DNA的纯度和浓度，-20 ℃保存备用。

1.2.2 PCR扩增 查询文献[11]设计SMPD1基因3、4号外显子扩增引物，并根据SMPD1基因序列(GenBank NC 000011.10)进行修正，两个外显子通用一个引物，由上海生工生物工程股份有限公司合成。上游引物：5′-ACTGTGAGCTCCTTGCAGGT-3′，下游引物：5′-TGCTCAAGGGAATTTTCAGC-3′，扩增产物片段长度667 bp。PCR反应体系共25 μL：Taq DNA聚合酶1 μL，DNA模板(50～100 ng/μL)1 μL，上下游引物各0.5 μL，10×PCR缓冲液(含有MgCl2)2.5 μL和2.5 mmol/L dNTP 1 μL，无菌ddH2O补足至25 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性4 min；95 ℃变性30 s，61 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环；最后72 ℃充分延伸5 min。

1.2.3 PCR产物基因测序 取PCR产物5 μL+6×Loading Dye 1 μL混匀，行1%琼脂糖凝胶电泳，D100Marker作为标准对照。紫外分光光度计确认扩增产物质量，将质量符合要求(条带大小正确，无杂带)的未纯化PCR产物委托上海生工生物工程股份有限公司进行基因突变测序。

1.2.4 基因序列比对 采用NCBI网站提供的Blast软件(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行比对。根据比对结果判别基因有无突变。

1.2.5 生物信息学分析 采用SIFT(Scale Invariant Feature Transform，http://sift.jcvi.org/)、I-Mutant2.0(http://folding.biofold.org/i-mutant/i-mutant2.0.html)和MUpro(http://mupro.proteomics.ics.uci.edu/)进行生物信息学分析，检验SMPD1基因上新的突变点对其编码的溶酶体酶SMase稳定性的影响。使用Mutation Taster(http://www.mutationtaster.org/)和PolyPhen2(http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/)检测突变点的致病性。

1.3 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件。基因频率和基因型分析采用基因计数法，计数资料以比例和率(%)表示，两组间比较采用χ2检验或Fisher精确概率法。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 琼脂糖凝胶电泳结果 PCR扩增产物的电泳条带呈单一明亮条带且清晰无杂质，目的条带大小为667 bp。见插页Ⅳ图6。

2.2 PCR产物测序突变分析 基因库中SMPD1基因p.A402T位点共有3种基因型：GG(野生纯合子)、GA(杂合子突变)、AA(纯合子突变)。经对测序结果序列比对发现，两组SMPD1基因存在p.A402T位点突变，均为杂合突变，即基因型为GA型。见插页Ⅳ图7。其中PD组SMPD1基因p.A402T位点突变概率为11.65%(12/103)，对照组为0.97%(1/103)，两组比较P<0.01。

2.3 生物信息学分析 SMPD1基因p.A402T突变很可能编码的溶酶体酶SMase稳定性降低(在I-Mutant2.0软件和MUpro软件上完成)，影响蛋白质的功能(在SIFT软件上完成)。Mutation Taster软件检测结果显示，SMPD1基因p.A402T存在致病突变位点；PolyPhen2软件检测结果显示，HumDiv为0.999，HumVar为0.939。见插页Ⅳ图8、表1。

表1 SMPD1基因突变的软件预测情况

注：SIFT得分<0.05为有害突变；PolyPhen2得分越接近1，突变致病性越高。

3 讨论

PD是一种以运动障碍为主要表现的神经系统变性疾病，其主要病理学特征是黑质致密部多巴胺能神经元进行性变性和脱失，以及细胞内以泛素和α-突触核蛋白为主要成分的路易小体的形成。迄今为止，PD的病因和发病机制尚未完全清楚，越来越多的研究认为，遗传因素在其发病中具有重要作用。据GWAS报道，很多易感基因或候选基因可导致PD的发病风险升高[12,13]，这些易感基因或候选基因通过不同路径损害细胞的新陈代谢。在PD发病机制中，细胞的溶酶体自我吞噬通路(ALP)即是其中的一种重要途径[14]。多巴胺能神经元胞质中异常蛋白质的积累可能是由于正常ALP通路功能紊乱引起，最终导致细胞凋亡和PD的临床表现。GBA和SMPD1编码的溶酶体酶在维持ALP通路的正常功能方面具有重要作用[14,15]。有研究已发现，SMPD1基因p.L302P位点突变使PD的发生率提高了9倍[4]，此为ALP通路在PD发病机制中的作用提供了额外证据。

SMPD1基因位于11p15.1～p15.4，全长共4 685 bp，包含6个外显子和5个内含子。其编码产物是由629个氨基酸组成的鞘磷脂酸性二酯酶1(SMase)，其是一种溶酶体酶，可裂解鞘磷脂胆碱磷酸头基，由此生成的神经酰胺在压力条件下作为第二信使启动凋亡反应。溶酶体是降解α突触核蛋白的主要的细胞器[16]，PD的病理特点是蛋白质(以α突触核蛋白为主)聚集形成路易小体[17]。SMPD1与GBA均是溶酶体基因，GBA和SMPD1基因编码的溶酶体分解酶GCase和SMase是否以类似的方式参与PD的发病机制尚无定论。有研究发现，他们有一个共同特点，即酶法分解的最终产物均是神经酰胺。神经酰胺代谢途径缺失能改变溶酶体酶的性能和功能，从而导致α突触核蛋白的积累和路易小体的形成，继而导致PD发病。PANK2和PLA2G6基因参与神经酰胺引起的神经退行性疾病(PANK2和PLA2G6分别引起1型和2型大脑铁沉积性神经退行性变)，其中也有路易小体的形成[16]，进一步证实上述结论。

近年研究发现，GBA突变可引起葡萄糖神经酰胺的聚集，从而阻止α突触核蛋白的降解，集聚的α突触核蛋白可促进其低聚物形成和神经毒性作用[17,18]；α突触核蛋白积累可阻碍GCase从内质网到溶酶体的转运，进一步损害溶酶体GCase的活性，从而增加路易小体的形成。因此，GCase活性的丧失创建了一个溶酶体功能减弱和α突触核蛋白积累的正反馈回路，最终导致神经退化。与GCase缺乏类似，SMase缺乏与α突触核蛋白相互作用从而促进神经毒性，继而导致PD的发展。

本研究在SMPD1基因上发现了一个新的突变点p.A402T，即该基因402号位点上的丙氨酸被苏氨酸取代，从而改变了其编码的蛋白质酶作用和活性。SIFT系统表明，该突变能够改变蛋白质的功能，I-Mutant2.0软件和MUpro软件对SMPD1基因p.A402T突变的评估亦支持上述结论。表明SMPD1基因p.A402T位点突变能够降低SMase的稳定性，该位点突变具有致病性。此外，本研究在PD患者中发现在尼曼匹克病中未出现过的p.A402T突变，这可能与筛选的中国尼曼匹克病病例数量有限有关。SMPD1突变引起的PD并不伴有独特的PD临床特点，其临床表现与GBA以及其他基因突变携带者表现相似。目前无法估计SMPD1基因突变在全世界PD发病机制中的作用，但这个发现为进一步了解PD潜在的发病机制具有重要意义。

综上所述，PD患者SMPD1基因存在p.A402T位点突变，该位点突变可能增加PD的发病风险。今后我们将加大样本对SMPD1基因进行检测，并对p.A402T位点进一步研究，为PD发病机制和治疗提供新的线索和潜在的药物作用靶点。

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