响应面法优化酶解提取带鱼内脏鱼油的工艺研究

邱小明，谢建华，2(.漳州职业技术学院食品与生物工程系，福建漳州 363000；2.农产品深加工及安全福建省高校应用技术工程中心，福建漳州 363000)

响应面法优化酶解提取带鱼内脏鱼油的工艺研究

邱小明1，谢建华1，2
(1.漳州职业技术学院食品与生物工程系，福建漳州 363000；2.农产品深加工及安全福建省高校应用技术工程中心，福建漳州 363000)

采用响应面法优化酶解提取带鱼内脏鱼油，在筛选出最优酶的基础上，进行单因素和响应面优化分析，结果发现胰蛋白酶酶解带鱼内脏提取鱼油的效果最好，用胰蛋白酶酶解得到鱼油的最佳工艺参数条件为：加酶量2.08 %，酶解温度38.34 ℃，pH值8.21，酶解时间180 min，预测鱼油提取率为79.0 %。为了方便实际操作，选取鱼油提取率的最佳工艺参数条件为：加酶量2.0 %，酶解温度38 ℃、pH值8.20，酶解时间180 min，得到的实际鱼油提取率78.66 %，这与预测值基本相吻合。因此，响应面法优化得到的最佳工艺参数可靠性较高。

响应面法；酶解法；带鱼；鱼油

带鱼又称白带鱼，是我国四大海洋经济鱼类之一，年捕捞达量达400多万吨，为我国最重要的海洋鱼类资源[1-2]。带鱼的利用主要被加工成鱼肉制品，而加工过程中产生的内脏、鱼头、鱼骨等下脚料占原料鱼的40 %左右[3]，目前主要用于生产饲料。鱼油中含有丰富的不饱和脂肪酸，具有降低胆固醇、治疗心脏病、抗衰老、抗疲劳、预防心肌梗塞等多种功效[4-5]。研究表明，带鱼的内脏含油量高，维生素A含量丰富[6]。目前，对于鱼油的提取主要采用蒸煮提取、溶剂提取、压榨、淡碱水解、酶解等方法[7]，溶剂提取、蒸煮提取、压榨对鱼油的提取率较低，淡碱水解提取不易控制，提取率不稳定，而酶解法提油具有提取率高、反应条件稳定、有效成分损失少等优点。因此，本文采用酶解法对带鱼内脏中的鱼油进行提取，研究不同的蛋白酶对鱼油提取的影响，并优化蛋白酶对带鱼内脏鱼油提取的工艺条件，得出最佳的酶解工艺参数，为带鱼的综合利用提供参考。

1 材料与设备

1.1 实验材料

带鱼，从漳州水产批发市场购得。

1.2 试剂

胃蛋白酶(3×104U/g)、胰蛋白酶(5×104U/g)、木瓜蛋白酶(2×105U/g)、中性蛋白酶(1×105U/g)、碱性蛋白酶(3×104U/g)均购于华顺生物技术有限公司；氢氧化钠、盐酸、石油醚等均为分析纯。

1.3 仪器

JA5003型电子分析天平(常州市宏衡电子仪器厂)，RE-6000A型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；DS-1型组织捣碎机(上海欣茂仪器有限公司)；PHS-3G型pH计(上海精密科学仪器有限公司)。

2 实验方法

2.1 原料预处理

将带鱼内脏取出，并捣碎成糊状冷藏备用。

2.2 酶解法提取带鱼内脏鱼油过程

精确称取带鱼内脏25 g于锥形瓶中，加水调节固液比，加氢氧化钠或盐酸溶液调节酶解pH值，加蛋白酶后摇匀密封，于水浴锅中加热到设定温度，摇匀后调节pH值使蛋白酶失活。酶解完成后，过滤残渣，得酶解液。

2.3 带鱼内脏鱼油提取工艺

2.3.1 带鱼内脏酶解蛋白酶的筛选

对带鱼内脏鱼油分别采用胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶5种蛋白酶进行提取，在各自最适的pH值、温度下，设置提取条件为酶添加量2.0 %，时间150 min，筛选出带鱼内脏鱼油提取率最高的酶。

2.3.2 酶解工艺的研究

2.3.2.1 带鱼内脏酶解单因素研究

在上述2.3.1筛选出最优酶的基础上，进行单因素实验，考察加酶量、酶解pH值、酶解温度、酶解时间等因素对带鱼内脏酶解的影响，计算鱼油提取率。

(1)加酶量对带鱼内脏鱼油提取率的影响。设定酶解pH值7.5、温度45 ℃、时间150 min，探讨不同加酶量(0.5 %、1.0 %、1.5 %、2.0 %、2.5 %)对带鱼内脏鱼油提取率的影响。

(2)酶解pH值对带鱼内脏鱼油提取率的影响。在上述(1)得出的最适加酶量的基础上，设定酶解温度45 ℃、时间150 min，探讨不同酶解pH值(6.5、7.0、7.5、8.0、8.5)对带鱼内脏鱼油提取率的影响。

(3)酶解温度对带鱼内脏鱼油提取率的影响。在上述(1)(2)得出的最适加酶量、酶解pH值的基础上，设定酶解时间150 min，探讨不同酶解温度(35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃)对带鱼内脏鱼油提取率的影响。

(4)酶解时间对带鱼内脏鱼油提取率的影响。在上述(1)(2)(3)得出的最适加酶量、酶解pH值、温度的基础上，探讨不同酶解时间(90 min、120 min、150 min、180 min、210 min)对带鱼内脏鱼油提取率影响。

2.3.2.2 响应面实验设计

在上述筛选出最优酶和单因素实验结果的基础上，以鱼油提取率作为指标，设计响应面实验确定带鱼内脏鱼油提取的最佳酶解工艺条件。

2.4 鱼油提取率计算

酶解鱼油的提取参照吴奎元的方法，采用萃取法，萃取条件为：石油醚75 mL、pH值4.0、温度40℃、时间为30 min[8]，并计算出提取鱼油的质量。

采用索氏抽提法测定粗脂肪含量，其操作参照国家标准“食品中粗脂肪的测定”(GB/T 14772-2008)进行。经测定，带鱼内脏的粗脂肪含量为8.69 %，说明带鱼内脏的粗脂肪含量较高。

3 结果与分析

3.1 带鱼内脏酶解蛋白酶的筛选

对带鱼内脏鱼油分别采用胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶5种蛋白酶进行提取，在各自最适的pH值、温度下，提取条件为酶添加量2.0%，时间150 min，筛选出带鱼内脏鱼油提取率最高的酶。其实验结果见表1。

表1 不同蛋白酶对带鱼内脏鱼油提取率的影响

从表1可知，胰蛋白酶酶解带鱼内脏鱼油提取率最高，达到了70.15%，其次为碱性蛋白酶，而中性蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶的提取效果较差。说明，酶对蛋白质的水解具有专一性，胰蛋白酶对带鱼内脏中蛋白质的肽键具有较好水解作用，可分离出相结合的脂肪分子。因此，本实验选择胰蛋白酶进行酶解带鱼内脏，并进一步优化提取鱼油的条件。

3.2 带鱼内脏酶解单因素研究

3.2.1 加酶量对带鱼内脏鱼油提取率的影响

用胰蛋白酶进行酶解，设定酶解pH值7.5、温度45 ℃、时间150 min，探讨不同加酶量对带鱼内脏鱼油提取率的影响，结果见图1。

图1 加酶量对带鱼内脏鱼油提取率的影响

从图1可知，带鱼内脏鱼油提取率随加酶量的增加先升高后降低，在加酶量为2.0 %时，鱼油提取率最高。随着加酶量的增加，酶解效率提升，但是酶过量时，可能酶本身也会产生水解而导致酶活性下降。

3.2.2 酶解pH值对带鱼内脏鱼油提取率的影响

用胰蛋白酶进行酶解，在上述3.2.1得出的最适加酶量的基础上，设定酶解温度45 ℃、时间150 min，探讨不同酶解pH值对带鱼内脏鱼油提取率的影响(图2)。

图2 不同酶解pH值下对带鱼内脏鱼油的提取率

由图2可以看出，带鱼内脏鱼油的提取率随酶解pH值的升高先增加后降低，用胰蛋白酶进行酶解，在pH值为8时，鱼油提取率最高。酶解pH值过高或过低都会影响到酶的活性以及底物与酶反应的动力学参数。

3.2.3 酶解温度对带鱼内脏鱼油提取率的影响

用胰蛋白酶进行酶解，在上述3.2.1、3.2.2得出的最适加酶量、酶解pH值的基础上，设定酶解时间150 min，探讨不同酶解温度对带鱼内脏鱼油提取率的影响,结果见图3。

图3 酶解温度对带鱼内脏鱼油提取率的影响

从图3可知，带鱼内脏鱼油提取率随酶解温度的升高先增加后降低，在温度为35 ℃和40 ℃时，鱼油提取有较好效果，其中40 ℃时鱼油提取率稍高于35 ℃。酶解温度过高或过低都会影响到酶的活性，影响酶对底物的作用效果，此外酶解温度过高也会引起鱼油发生氧化作用。

3.2.4 酶解时间对带鱼内脏鱼油提取率的影响

用胰蛋白酶进行酶解，在上述3.2.1、3.2.2、3.2.3得出的最适加酶量、酶解pH值、温度的基础上，探讨不同酶解时间对带鱼内脏鱼油提取率的影响，结果见图4。

图4 酶解时间对带鱼内脏鱼油提取率的影响

从图4可知，带鱼内脏鱼油提取率随酶解时间的延长而升高，在酶解时间达到180 min后，鱼油提取率趋于平稳。这是因为，带鱼内脏中蛋白质逐渐被胰蛋白酶水解，分离出相结合的脂肪分子，随着反应的进行，内脏中蛋白质逐渐减少，在反应180 min后，蛋白质大部分被水解，脂肪分子也基本被释放出，延长反应时间，鱼油提取率升高也不明显。

3.3 响应面优化酶解带鱼内脏内脏鱼油的实验结果

3.3.1 响应面实验方案

从上述单因素实验结果可以看出，加酶量、酶解温度、pH值对鱼油提取率的影响显著。因此，依据Design Expert(version 8.0.3)软件的Box-Benhnken实验设计原理，以鱼油提取率为响应值，以加酶量、酶解温度、pH值为考察指标，实验方案设计三因素三水平，对提取条件开展响应面分析，各因素水平见表2。

表2 Box-Behnken实验因素水平表

3.3.2 实验结果与分析

以Y(%)鱼油提取率为响应值，A(加酶量)、B(酶解温度)、C(pH值)三因素为自变量，实验结果见表3。

表3 响应面实验设计与结果

3.3.3 实验数据处理分析

利用Design Expert软件，建立鱼油提取率Y与影响因素之间关系的数学模型为：Y=-74.36500+1.51348A+8.59080B+0.84930C-0.05200AB-0.003AC-0.015BC-0.00781A2-5.042B2-0.02255C2。

其中，Y为鱼油提取率(%)，A为加酶量(%)，B为酶解温度(℃)，C为pH值。

表4 回归模型方差分析

通过表4的回归模型方差分析可知，P值小于0.001，R2=0.9863，模型具有极显著性，说明该数学模型能很好地解释98.63 %的鱼油提取率的变化。从表4可知，A、B、C三因素对鱼油提取率Y影响均极显著(P<0.01)，且酶解温度和pH值的影响程度高于加酶量。BC对鱼油提取率Y的影响也显著(P<0.05)。而回归模型的失拟相不显著(P=0.2034>0.05)，说明该数学模型与真实响应面的拟合度较高。

3.3.4 响应面分析

图5 加酶量与酶解温度对鱼油提取率的响应面图及等高线图

从图5可知，响应面的坡度比较陡，不同水平的酶解温度和加酶量对鱼油提取率的影响显著，与加酶量相比，不同酶解温度水平对响应曲线最高值影响较为显著。从等高线图可知，整个图形呈椭圆形，说明加酶量与酶解温度的交互作用比较明显。

图6 pH值与酶解温度对鱼油提取率的响应面图及等高线图

如图6所示，响应面的坡度比较陡，说明不同水平的酶解温度和pH值对鱼油提取率的影响显著。从pH值与酶解温度的等高线图可知，整个图形呈椭圆形，说明pH值与酶解温度的交互作用对鱼油提取率的影响较小。

图7 加酶量与pH值对鱼油提取率的响应面图及等高线图

如图7所示，不同水平的加酶量对pH值的响应曲线最高值影响相对较小，而不同pH值对加酶量的响应曲线最高值影响比较高。从等高线图可知，整个图形呈近椭圆形，两者之间的交互作用显著。

3.4 最佳提取方案验证

从上述的方差分析和响应面分析可知，加酶量、酶解温度、pH值三因素对鱼油提取率的影响均极显著，且从这三个因素间交互作用的响应面图和等高线图可知，鱼油提取率存在最高值。因此，对鱼油提取率与影响因素之间关系的数学模型进行优化分析，得到最高鱼油提取率的最佳工艺参数条件为：加酶量2.08 %、酶解温度38.34 ℃、pH值8.21、酶解时间180 min，预测鱼油提取率为79.0 %。为了方便实际操作，选取鱼油提取率的最佳工艺参数条件为：加酶量2.0 %、酶解温度38 ℃、pH值8.20、酶解时间180 min，得到的实际鱼油提取率78.66 %，这与预测值基本相吻合。因此，响应面法优化得到的最佳工艺参数可靠性较高。

4 结论

带鱼内脏中含油量较高，酶解法提油具有提取率高、反应条件稳定、有效成分损失少等优点。本文采用响应面法优化酶解提取带鱼内脏鱼油，在筛选出最优酶的基础上，进行单因素和响应面优化分析，胰蛋白酶酶解带鱼内脏提取鱼油的效果最好，响应面法优化得到的最佳工艺参数可靠性较高。

[1]谢超,邓尚贵,夏松养,等.带鱼下脚料蛋白水解物的营养成分分析[J].营养学报,2009,31(4):402-404.

[2]沈月新.水产食品学[M].北京:中国农业出版社,2001.

[3]黄镇繁.带鱼下脚料蛋白质提取与分离研究[J].渔业现代化,2008,35(5):52-55.

[4]王晓龙.鲐鱼鱼油提取精制及抗氧化活性研究[D].舟山：浙江海洋学院,2014.

[5]杨小克.鱿鱼内脏的鱼油提取工艺及综合利用研究[D].青岛：中国海洋大学，2012.

[6]郝淑贤,石红,李来好.酶法提取鲟鱼油工艺的研究[J].食品科学,2009,17(l):35-40.

[7]邵娜.刘学军.胰蛋白酶法提取草鱼内脏鱼油工艺优化[J].食品科学,2013,26(4):44-48.

[8]吴奎元.酶解带鱼内脏提取鱼油及防止其氧化研究[D].福州：福建农林大学，2011.

Optimization of Enzyme Hydrolysis of Oil From Hairtail Viscera by Response Surface Method

QIU Xiao-ming1，XIE Jian-hua1,2

(1.Foods and Biology Engineering Department, Zhangzhou Institute of Technology, Zhangzhou Fujian 363000,China；2.The Applied Technical Engineering Center of Further Processing and Safety of Agricultural Products，Higher Education Institutions in Fujian Province， Zhangzhou Fujian 363000,China)

To optimize the extraction technique for oil from hairtail viscera by enzyme hydrolysis,based on the optimal enzyme, single factor and response surface method were used to optimize the enzymolysis conditions in the extraction process. The result showed that trypsin enzyme has the best effect on the extraction of hairtail viscera oil，and the optimal enzymolysis conditions was the amount of enzyme 2.08 %, enzymolysis temperature 38.34 ℃, the pH value 8.21, and the enzymolysis time 180 min. In actual operation, the optimal process conditions of hairtail viscera oil instead: the amount of enzyme 2.0 %, enzymolysis temperature 38 ℃, the pH value 8.20，the enzymolysis time 180 min，the oil extraction rate is 78.66 %, was consistent with the theoretical value. This suggested that the optimal enzymolysis conditions has high reliability.

response surface method; enzymolysis; hairtail; fish oil

2016-12-25

福建省自然科学基金项目“葡甘聚糖仿生膜的构建及性能研究”(2014J01378)；福建省中青年教师教育科研项目“采用鱼加工下脚料为原料制备高纯度鱼胶原蛋白的研究”(JAT160870)。

邱小明(1979- )，男，讲师，硕士，从事食品生物技术与生物化工研究。

Q503

A

2095-7602(2017)06-0070-07