益气养血方对膝骨关节炎模型大鼠血清Wnt4和WIF1的影响

李翠葳++郑喜++李兆福++祁燕++万春平++李小丝++管政

【摘 要】目的：探討益气养血方对膝骨关节炎大鼠血清Wnt4、WIF1水平及膝关节软骨组织的影响，揭示其治疗骨关节炎的部分机制。方法：将70只SD大鼠随机分为益气养血方低、中、高剂量组，阳性对照组，模型对照组，空白对照组及假手术组，每组10只。除空白对照组和假手术组外，其余各组大鼠采用改良Hulth法构建膝骨关节炎模型；假手术组仅切开关节囊，不切断韧带和半月板。造模成功后，益气养血方低、中、高剂量组分别予益气养血方1.89 g·kg-1·d-1、3.78 g·kg-1·d-1、7.56 g·kg-1·d-1灌胃，阳性对照组给予双氯芬酸钠肠溶片混悬液4 mg·kg-1·d-1灌胃，模型对照组、假手术组给予生理盐水

2.5 mL·d-1灌胃，空白对照组不予任何药物。给药8周后，腹主动脉取血，检测血清中Wnt4、WIF1的含量；取右膝关节，HE染色，并进行病理评分。结果：与模型对照组比较，益气养血方各剂量组及阳性对照组病理评分降低（P < 0.05）；与空白对照组、假手术组比较，模型对照组大鼠血清中Wnt4水平升高、WIF1水平降低（P < 0.05）；与模型对照组比较，益气养血方中、高剂量组大鼠血清中Wnt4水平降低，WIF1水平升高（P < 0.05或P < 0.01）；与阳性对照组比较，益气养血方中、高剂量对WIF1的上调作用更为明显（P < 0.05）。结论：益气养血方能延缓骨关节炎软骨退变，保护关节软骨，其机制可能与下调Wnt4的表达，上调WIF1的水平，抑制关节软骨退变相关。

【关键词】 骨关节炎，膝；益气养血方；软骨形态；Wnt4；WIF1

【ABSTRACT】Objective：To investigate the effect of Yiqi Yangxue Fang（益气养血方）on Wnt4 andWIF1in serum of rats with knee osteoarthritis，to reveal its mechanism in the treatment of osteoarthritis.Methods：Seventy SD rats were randomly divided into low，middle and high dose groups of Yiqi Yangxue Fang，a positive control group，a model control group，a blank control group and a sham operation group，10 rats in each group.Except for the blank control group and the sham operation group，the knee osteoarthritis models were established by modified Hulth method in the other groups.Only the joint capsule was cut open in the sham operation group，and the ligaments and menisci were not cut off.After modeling，rats in the low，medium and high dose group were respectively given intragastric administration of 1.89 g·kg-1·d-1，3.78 g·kg-1·d-1 and 7.56 g·kg-1·d-1 of Yiqi Yangxue Fang.The positive control group was given intragastric administration of 4 mg·kg-1·d-1 of Diclofenac Sodium Enteric-coated Tablets suspension.The model control group and the sham operation group were given 2.5 mL·d-1 of normalsaline.The blank control group wasn't given any drug.After 8 weeks of administration，the blood of abdominal aorta was collected to detect he contents of Wnt4 and WIF1 in serum.The right knee joint was taken for HE staining and pathological score.Results：Compared with the model group，the pathological scores of each group of Yiqi Yangxue Fang and the positive control group decreased（P < 0.05）.Compared with the sham operation group and the blank control group，the level of Wnt4 increased and the level of WIF1 decreased in the model control group（P < 0.05）.Compared with the model control group，the level of Wnt4 could be lowered and the level of WIF1 could be increased in the medium and high dose group of Yiqi Yangxue Fang（P < 0.05 or P < 0.01）.Compared with the positive control group，the medium and high dose of Yiqi Yangxue Fang are more obviously to up-regulate the level of WIF1（P < 0.05）.Conclusion：Yiqi Yangxue Fang can delay cartilage degeneration and protect articular cartilage，and its mechanism may be related to down regulation of Wnt4，up regulation of WIF1 level and inhibition of articular cartilage degeneration.

【Keywords】osteoarthritis，knee；Yiqi Yangxue Fang（益气养血方）；cartilage morphology；Wnt4；WIF1

骨关节炎（osteoarthritis，OA）是临床上中老年人常见的一种慢性、进展性关节疾病，多由增龄、肥胖、劳损、创伤、关节先天性异常、关节畸形等因素引起關节软骨变性、软骨下骨硬化、关节边缘和软骨下骨反应性增生、骨赘形成，产生无菌炎症，可侵犯全身多个关节[1]。临床上以膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）多见。最近研究表明，原发性OA在我国40岁以上人群中患病率为46.3%，

60岁人群比40岁人群的患病率高出一倍。本病的致残率可达53%[2]。Wnt/β-catenin信号通路是骨代谢调控的重要途径之一，在骨组织的形成、发育及骨重建过程中起关键作用，与OA的发生发展密切相关[3-5]。中医学认为，本病是风、寒、湿三气杂合入侵人体，使气血凝滞不行，痹阻不通。吴生元[6]认为，本病以肝脾肾亏、气血不足为本，痰浊、瘀血、风寒湿邪为标，采用益气养血、温阳通络等法进行治疗可取得不错的疗效。益气养血方为吴氏经验方，临床运用30余年，疗效较好。前期实验表明，本方可以抑制ATDC5软骨细胞凋亡，降低细胞上清液炎性因子白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子-α产生及Bax蛋白表达，上调ATDC5软骨细胞Bcl-2蛋白表达，从而发挥治疗OA的作用[7]。

本研究是在前期研究基础上，从调控Wnt通路相关分子角度进一步探讨益气养血方对OA软骨退变的作用及机制。

1 实验材料

1.1 实验动物 SPF级SD雌性大鼠70只，2月龄，体质量160～180 g，由成都达硕实验动物有限公司提供，动物许可证号：SCXK（川）2015-030）。

质量合格证号：No.0015199。由四川省实验动物检测中心检测。饲养于云南省中医医院中心实验室SPF级动物房[许可证号：SYXK（滇）-K2013-0002]。温度（21±2）℃，湿度（55±5）%，

12 h光暗循环。饲料和水均由动物自由摄取，所有笼具、饲料和饮水均经过121 ℃蒸汽灭菌处理。实验期间均予SPF级普通饲料。

1.2 实验药物 益气养血方由黄芪、党参等14味中药组成，由云南中医学院第一附属医院中药房提供。原药材混合后加水煎煮3次，第1次10倍水，煎煮1 h，滤过。第2次7倍水，煎煮1 h，滤过。第3次3倍水，煎煮30 min，滤过。合并3次滤液，3000 r·min-1离心机离心10 min，60 ℃恒温旋转蒸发仪蒸馏浓缩制备浸膏，称重，折合原药材为每1克浸膏含生药2.53 g。双氯芬酸钠肠溶片（北京诺华制药有限公司，生产批号X1008）。

1.3 主要试剂和设备 Wnt4、WIF1 ELISA试剂盒（美国R&D，生产批号E20160901A、E20160901C）；乙二胺四乙酸二钠、复方金霉素软膏（昆明振华制药厂，生产批号20150701）；采血管、Bio-Rad 680酶标仪（美国伯乐公司）；Megafugel 1.0R离心机、RM2235石蜡切片机、EG1150H + EG1130C组织包埋机、HI1210烘片机、DM2500正置显微镜、ASP300S全自动组织脱水机（德国莱卡仪器有限公司）。

2 方 法

2.1 动物分组与造模 将70只大鼠按照随机数字表法分为益气养血方低、中、高剂量组，阳性对照组，模型对照组，空白对照组及假手术组，每组10只。除空白对照组及假手术组外，其余各组大鼠用改良Hulth法[8]造模，采用质量分数为10%的水合氯醛腹腔麻醉后，碘伏消毒，均取右侧膝关节内侧长约

1 cm切口，从髌韧带内侧进入关节腔，切断前交叉韧带、内侧副韧带，切除内侧半月板，抽屉试验阳性，关节复位后逐层缝合切口。假手术组入路同前，切开关节囊，暴露关节腔后，不切断前交叉韧带、内侧副韧带，不做半月板切除，随即缝合切口。复方金霉素软膏涂抹伤口预防感染，连续给药7 d。空白对照组不做任何处理。

2.2 动物给药 造模7周后，依据临床常用剂量，按人与大鼠体表面积比计算大鼠临床等效剂量，人按70 kg计算出大鼠用药量益气养血方高、中、低剂量组分别为7.56 g·kg-1·d-1、3.78 g·kg-1·d-1、1.89 g·kg-1·d-1（分别为临床等效剂量、1/2等效剂量、1/4等效剂量），实验时以双蒸水按剂量配置成所需浓度；阳性对照组给予双氯芬酸钠肠溶片混悬液4 mg·kg-1·d-1灌胃；假手术组、模型对照组给予生理盐水2.5 mL·d-1灌胃；空白对照组正常饲养，不予任何药物。各组连续给药8周。

2.3 标本制备 采用质量分数为10%的水合氯醛腹腔麻醉，腹主动脉取血，血液静置4 h后，4 ℃ 3000 r·min-1离心机离心15 min，取上层血清，冻存-20 ℃，以备ELISA检测。取右侧膝关节，每组随机选取5个关节，剩余关节冻存于-80 ℃冰箱，以备PCR检测。剥离关节周围组织，置于质量分数为10%的中性甲醛溶液中固定，采用质量分数为10%的EDTA脱钙，常规脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，连续切片，厚度6 μm。

2.4 检测指标及方法

2.4.1 形态学观察 大体观察，HE染色，光镜下观察，每个标本取5张切片，每张切片显微镜下放大200×，选取5个视野。参照Mankin评分法[9]设置以下评分标准进行关节软骨病理评分。软骨结构：光滑如常，0分；表层破坏，1分；血管翳及表层破坏，2分；浅层裂隙形成达移行层，3分；裂隙局限性深达骨质辐射层，4分；深达骨质钙化层软骨，5分；全层软骨缺损，6分。软骨细胞：数量如常排列整齐，0分；数量弥漫性增多，1分；出现大量集簇细胞团，2分；数量明显减少，3分。基质染色：均匀，层次分明清楚，0分；不均匀，层次分明清楚，1分；不均匀，部分层次不清，2分；不均匀，重度染色，3分；失染，4分。潮线完整性：完整，1分；有血管翳生成，2分。

2.4.2 ELISA法检测大鼠血清Wnt4、WIF1表达水平 按照试剂盒说明书。操作如下：①从-20 ℃冰箱中取出冰冻血清，室温解冻备用。将试剂盒从4 ℃冰箱取出，室温平衡20 min。②选用96 T板，设标准孔和待测样品孔。标准品孔各加不同浓度的标准品50 μL，样品孔加入待测样品10 μL，再加样本稀释液40 μL，空白孔不加。

③除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔均加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100 μL，用封板膜密封。④37 ℃恒温箱温育60 min后，揭掉封板膜，弃去液体，在吸水纸上拍干，每孔加足量的洗涤液，静置1 min，将洗涤液甩去，吸水纸上拍干，如此反复5次（注意洗板时要甩尽液体，拍干，以免影响结果）。⑤每孔加入底物溶液100 μL，37 ℃避光温育15 min。每孔依次加终止液50 μL，终止反应（此时颜色改变，一般颜色越深说明阳性程度越高）。⑥在加入终止液的15 min内用酶联仪在450 nm波长处测定各孔的光密度（OD值）。同时绘制标准曲线。

2.5 统计学方法 采用SPSS 18.0软件进行统计分析。计量资料以表示，组间比较采用t检验，多组间数据比较采用单因素方差分析，符合正态分布和方差齐性检验采用LSD法检验，方差不齐则采用校正t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 大体形态观察 空白对照组可见关节面平滑完整，关节软骨光洁，半透明，质地坚韧富有弹性，无裂隙，膝关节未见肿胀及萎缩，关节囊未见增厚，滑膜无充血粘连，关节液量少清澈。模型对照组可见滑膜增厚充血，软骨表层糜烂纤维化，触之较软，胫骨平台可见增生，关节囊增厚，关节积液明显增多，浑浊黏稠；阳性对照组滑膜充血较轻，软骨颜色变浅，软骨表面粗糙，局部溃疡、纤维化，关节液量较多，浑浊。益气养血方各剂量组滑膜较模型对照组充血较轻，软骨表层比较光滑，未见明显裂隙与增生，关节积液量少。

3.2 HE染色 空白对照组、假手术组可见软骨表层光滑，平整，软骨细胞排列整齐，染色分布均匀，潮线完整，无明显细胞集簇现象；模型对照组软骨表层溃疡变薄，局部裂隙缺损，软骨细胞排列不整齐，局部细胞集簇明显，局部细胞数量减少，染色不均匀；阳性对照组软骨层变薄，表层欠光滑、裂隙，软骨细胞排列尚整齐，少量集簇，染色不均匀、轻度缺失，潮线完整；益气养血方低剂量组软骨表层不光滑，部分溃疡，软骨细胞排列紊乱，细胞集簇，基质染色不均匀，潮线完整；益气养血方中剂量组软骨表层欠光滑，局部有表浅的裂隙，软骨细胞排列较规则，局部细胞集簇，基质染色尚均匀，潮线较完整；益气养血方高剂量组软骨表层较光滑，软骨细胞集簇，无明显裂隙，潮线完整。见图1。

3.3 各组大鼠关节软骨病理评分比较 模型对照组的病理评分明显高于空白对照组、假手术组（P < 0.05），益气养血方各剂量组及阳性对照组低于模型对照组（P < 0.01），益气养血方中、高剂量组病理评分低于阳性对照组（P < 0.05或P < 0.01）。见表1。

3.4 各组大鼠血清Wnt4、WIF1水平比较 与空白对照组、假手术组比较，模型对照组大鼠血清中Wnt4水平升高，WIF1水平降低（P < 0.05或P < 0.01）；与模型对照组比较，益气养血方中、高剂量组大鼠血清中Wnt4水平降低，WIF1水平升高（P < 0.05），其中高剂量组更为明显（P < 0.01）；与阳性对照组比较，益气养血方中、高剂量对WIF1的上调作用更为明显（P < 0.05）。见表2。

4 讨 论

目前，KOA尚缺乏有效的治疗手段，临床常用非甾体抗炎药、糖皮质激素、改善病情抗风湿药等治疗。阳性对照药物双氯芬酸钠肠溶片为非甾体抗炎药，通过抑制环氧合酶（COX）的活性，使前列腺素的合成减少，从而减轻或控制炎症反应。有研究表明，双氯芬酸可以抑制Wnt/β-catenin信号传导，同时减少β-catenin/TCF依赖性基因的表达且能够促进人OA软骨细胞分泌Ⅱ型胶原[10]，从而减少软骨基质的降解丢失，保护关节软骨；但对β-catenin蛋白水平的影响不明显[11]。氨基葡萄糖能够促进蛋白多糖的合成，提高软骨细胞的修复能力，抑制溶酶体酶、金属蛋白酶、胶原酶和磷脂酶A2等水解酶的释放，减少关节软骨基质的降解破坏，从而保护和修复关节软骨；但对Wnt/β-catenin通路是否有作用未见报道，本研究旨在研究益气养血方通过Wnt/β-catenin信号通路干预OA的机理，故以COX-2抑制剂双氯芬酸钠肠溶片为阳性对照药物。

经典的Wnt/β-catenin信号通路可以调节机体很多生物学过程如细胞增殖、分化、凋亡、衰老等[12]，在软骨、骨代谢及骨骼系统发生发展的全过程及OA的病程中起着重要作用[13]。Wnt4是Wnt信号通路中的重要因子之一，其表达增高可激活下游的β-catenin过量表达，促使关节软骨细胞过度成熟、分化及凋亡，使存在于软骨基质中的各种蛋白酶的表达及活性增加，从而加重细胞外基质（ECM）的降解、关节软骨的退变和最终骨赘的形成[14]。WIF1即Wnt信号通路抑制因子1，为Wnt拮抗物家族成员之一，可以直接与Wnt相结合，阻断Wnt与受体蛋白复合物的结合途径，促使细胞质中的β-catenin不断磷酸化而难以积累，从而阻断Wnt/β-catenin信号通路的活化[15-16]，减少ECM的降解和关节软骨的破坏。本研究表明，模型对照组大鼠关节软骨表层溃疡变薄，HE染色关节软骨表面缺损裂隙，细胞集簇，基质染色不均匀，提示关节软骨基質降解，关节软骨退变；益气养血方各剂量组和阳性对照组在关节软骨表层肉眼观察、HE染色关节软骨退变有明显改善，病理评分降低（P < 0.05），表明益气养血方可以改善KOA大鼠病理评分，保护关节软骨。

Wnt4和WIF1作为Wnt/β-catenin信号通路上游因子，通过对Wnt信号及β-catenin水平的调控，调节机体细胞周期、ECM合成与降解及软骨细胞的成熟、分化与凋亡[17]。Wnt4持续增高引起β-catenin持续表达，促使生长板软骨细胞肥大及其终端分化，刺激基质金属蛋白酶分泌，致使关节软骨基质降解，加速关节软骨破坏[13]。Wnt的异常活化使WIF1消耗增多、水平降低，β-catenin持续在细胞质内积累，并向细胞核转移，继而与转录因子TCF/LEF结合，刺激Wnt信号下游靶基因转录[18]。本研究结果提示，模型对照组Wnt4水平明显高于空白对照组和假手术组（P < 0.05），WIF1水平低于后两者（P < 0.01）。与模型对照组比较，益气养血方各剂量组和阳性对照组Wnt4水平均有所降低，WIF1的表达升高，但阳性对照组差异无统计学意义（P > 0.05）。表明益气养血方可以降低Wnt4的产生水平，增加WIF1的表达。

益气养血方又名补中桂枝汤，以李东垣补中益气汤与《伤寒论》桂枝汤合方化裁而成，具有益气养血、补肾健脾、通经活络之功，临床运用30余年，取得较好的临床疗效，且无明显不良反应。方中以补中益气汤调补脾胃、益气养血，桂枝汤调和营卫、通经活络，配以细辛散寒止痛，川芎行气活血，骨碎补、淫羊藿补肾壮骨，标本兼治。研究表明，本方可以改善OA患者临床症状积分，降低红细胞沉降率、C-反应蛋白[19]；对体外培养的OA患者退变软骨细胞增殖有促进作用，促使Aggrecan mRNA表达上调，下调COL-10 mRNA的表达[20]。本研究从Wnt信号通路上游调控分子角度探讨益气养血方对KOA大鼠血清Wnt4、WIF1水平及膝关节软骨组织的影响，揭示其治疗OA的部分机制。研究结果表明，益气养血方可以有效延缓KOA大鼠关节软骨的退变，改善KOA大鼠病理评分，推测其可能的作用机制是通过抑制Wnt4的表达，升高WIF1的水平，从而减少β-catenin的产生、积累，延缓KOA软骨退变。但信号通路是一个复杂的协同系统，本方对滑膜及软骨组织中相关因子下游相关靶基因如β-catenin及其他OA的相关信号通路的作用及其机制，还需进一步研究和探讨。

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收稿日期：2017-03-05；修回日期：2017-05-31