土茯苓组方对急性肝衰竭大鼠保护作用的实验研究

郭秋芳 赵康路 郭意男 叶卫江⋆

土茯苓组方对急性肝衰竭大鼠保护作用的实验研究

郭秋芳 赵康路 郭意男 叶卫江⋆

目的 观察土茯苓组方对急性肝衰竭（ALF）大鼠Bcl-2和Caspase-3蛋白及细胞炎症因子表达的影响，验证其确切疗效及防治急性肝衰竭的作用机制。方法 40只Wistar雄性大鼠随机分为正常组、模型组、土茯苓组及乙酰半胱氨酸组。土茯苓和乙酰半胱氨酸组造模前3d分别予土茯苓水煎液5ml/（kg·d）及乙酰半胱氨酸50mg/（kg·d）灌胃（土茯苓水煎液含生药浓度2g/ml，乙酰半胱氨酸溶液浓度为1mg/ml），采用D-氨基半乳糖（D-GalN）/内毒素脂多糖（LPS）腹腔注射造成大鼠ALF模型。造模6h后，取血检测血清天冬氨酸转氨酶（AST）、丙氨酸转氨酶（ALT）、总胆红素（TBIL）含量，采用酶联免疫法（ELISA）检测TNF-α、IL-6、IL-10，并开腹取大鼠肝组织，应用Western Blot实验方法分别检测肝组织中Bcl-2和Caspase-3蛋白表达情况。结果 与正常组比较，模型组大鼠血清AST、ALT、TBIL、TNF-α、IL-6、IL-10含量和Caspase-3蛋白表达均明显升高（P＜0.05），Bcl-2蛋白表达明显下降（P＜0.05）；与模型组比较，土茯苓组和乙酰半胱氨酸组血清AST、ALT、TBIL、TNF-α、IL-6、IL-10含量和Caspase-3蛋白表达显著下降（P＜0.05），Bcl-2蛋白表达明显显著升高（P＜0.05）；与乙酰半胱氨酸比较，土茯苓组血清AST、ALT、TBIL、TNF-α、IL-6、IL-10含量和Caspase-3蛋白表达略高（P＞0.05），Bcl-2蛋白表达略低（P＞0.05）。结论 土茯苓可明显减轻急性肝衰竭大鼠肝脏损伤，其作用机制可能与上调Bcl-2蛋白、下调Caspase-3蛋白，从而抑制细胞凋亡，以及干预促炎因子及抗炎因子有关。

急性肝衰竭 细胞凋亡 炎症因子 土茯苓 大鼠

急性肝衰竭（ALF）是由多种因素引起的肝脏严重损害，未经肝脏移植者病死率＞90%［1-3］。肝细胞凋亡的发生受Fas/FasL、Bcl-2和Caspase-3蛋白家族等多因素的调节［4］。另外，促炎因子TNF-α、IL-6及抗炎因子IL-10在肝衰竭中同样发挥重要作用［5-6］。临床研究发现土茯苓组方可以明显改善肝衰竭患者的症状及预后，但其作用机制尚不明确［7］。2015年5月至2016年6月作者通过实验研究，观察土茯苓对急性肝衰竭大鼠Bcl-2和Caspase-3蛋白及细胞炎症因子表达的影响，探讨其防治急性肝衰竭的作用机制，为临床应用提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物 清洁级雄性Wistar大鼠40只，体重（200±20）g，由浙江中医药大学实验动物中心提供。1.2 试剂和药品 D-GalN购自美国Sigma公司；LPS购于美国Sigma-Aldrich公司；AST、ALT、TBIL检测试剂盒、TNF-α、IL-6、IL-10试剂盒、Bcl-2 和Caspase-3试剂盒均购自上海拜力生物科技有限公司；土茯苓组方水煎浓缩含生药浓度为2g/ml，土茯苓水煎液，置于冰箱4℃保存备用。

1.3 动物分组和给药 Wistar大鼠40只，采用数字表法随机分为正常对照组10只，模型组10只，土茯苓组10只，乙酰半胱氨酸组10只。土茯苓组大鼠造模前3d予土茯苓水煎液5ml/（kg·d）灌胃，乙酰半胱氨酸组造模前3d予乙酰半胱氨酸50mg/（kg·d）灌胃，正常组和模型组予等量生理盐水，1次/d。

1.4 造模方法 末次给药1h后，模型组、土茯苓组及乙酰半胱氨酸组均予D-氨基半乳糖（D-GalN）

2 结果

2.1 各组大鼠血清ALT、AST、TBIL含量比较 与正常组比较，模型组大鼠血清AST、ALT和TBIL含量明显升高（均P＜0.05）；与模型组相比较，土茯苓组和乙酰半胱氨酸组大鼠血清AST、ALT和TBIL含量均明显下降（均P＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠血清ALT、AST、TBIL含量比较（x±s）

2.2 各组大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-10含量比较 与正常组比较，模型组大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-10含量明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，土茯苓组和乙酰半胱氨酸组大鼠TNF-α、IL-6、IL-10均值均明显降低，但土茯苓组与模型组大鼠TNF-α差异无统计学意义（P＞0.05），余均有统计学意义（均P＜0.05）。见表2。

表2 各组大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-10含量比较（x±s）

2.3 各组大鼠肝组织Bcl-2和Caspase-3蛋白表达的比较 与正常组比较，模型组大鼠肝组织Bcl-2蛋白表达明显下降，Caspase-3蛋白表达明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，土茯苓组和乙酰半胱氨酸组Caspase-3蛋白表达均明显下调，Bcl-2蛋白表达明显上调（均P＜0.01）。见表3。

表3 各组大鼠肝组织Bcl-2和Caspase-3蛋白表达的比较

3 讨论

研究表明，肝细胞凋亡在肝衰竭过程中发挥着重要作用，是肝衰竭过程中重要环节［8］，抑制肝细胞凋亡成为防治急性肝衰竭的重方法之一，同时强调细胞因子在ALF病理过程中的作用［9］，检测其血清水平有助于判断疾病严重程度及预后转归。Caspase是一组天门冬氨酸特异性的半胱酸蛋白酶，其活化是细胞凋亡的最终执行，在凋亡级联激活中处于核心地位［10］。而Caspase-3的激活在肝细胞凋亡中起重要作用，Bcl-2可通过抑制Caspase-3的活性抑制细胞凋亡［11］。TNF-α、IL-6、 IL-10是ALF发病过程由肝脏内外的单核-巨释系统释放的细胞因子。其中TNF-α、IL-6可激活炎症级联反应，介导细胞损伤，是肝细胞急性炎症反应的主要参与者，能较好的反映急性肝损伤的程度，而IL-10具有较强的抗炎及免疫抑制活性，在ALF中起着一定的保护作用［12］。D-GalN联合LPS腹腔注射造成大鼠急性肝衰竭模型被国内外学者普遍认可及使用，造模6h后可见大量肝细胞凋亡，与临床急性肝衰竭的发生机制相似，是研究急性肝衰竭细胞凋亡机制及细胞因子产生较理想模型［13］。

中医无ALF的类似病名，根据身黄目黄伴神志昏蒙的症状，多纳入“急黄”、“瘟黄”、“疫黄”及“肝厥”等范畴，对于肝衰竭病因的探讨主要集中在毒、湿、热、瘀、虚，病位于肝，横连于胆，克伐脾胃，对于病机，急性和亚急性肝衰竭主要是疫毒炽盛、热入营血、上扰心神，慢加急性肝衰竭主要为湿热内蕴、脾气亏虚、气虚血瘀［14］；治疗上以清热、祛湿、解毒、开窍、健脾为普遍共识［15］。土茯苓组方（以土茯苓和玄参均100g以上为君药的中药组方）具有“祛湿通腑，排毒清肝”的功效。其中土茯苓主要功效为清热利湿、解毒镇痛，可选择性地抑制细胞免疫［16］，玄参为“清热解毒”常用药，可明显抑制肝细胞凋亡，上调Bcl-2蛋白表达，下调Fas/FasL表达［17］。

本资料结果表明，与正常组比较，模型组大鼠血清Caspase-3蛋白表达均明显升高，Bcl-2蛋白表达明显下降，表明Bcl-2蛋白表达与肝细胞凋亡呈负相关，Caspase-3蛋白表达与肝细胞凋亡呈正相关。土茯苓组AST、ALT、TBIL、TNF-α、IL-6、IL-10含量和Caspase-3蛋白表达显著下降，Bcl-2蛋白表达明显显著升高，提示土茯苓组方可减轻急性肝衰竭大鼠肝损害及抑制细胞凋亡，其机制可能与上调Bcl-2蛋白表达和下调Caspase-3蛋白表达有关。与乙酰半胱氨酸比较，土茯苓组血清AST、ALT、TBIL、TNF-α、IL-6、IL-10含量和Caspase-3蛋白表达略高（P＞0.05），Bcl-2蛋白表达略低（P＞0.05），进一步证实土茯苓组方可减轻急性肝衰竭大鼠肝损害及抑制细胞凋亡。

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Objective To observer the effects of smilax prescription on expressions of Bcl-2，Caspase-3 and cytokines in rats with acute liver failure and to verify its exact effect and the possible mechanism. Methods Forty Wistar rats were divided into normal group，model group，smilax prescription group and acetylcysteine group. The smilax prescription group was given smilax prescription solution 10mg/（kg·d），the acetylcysteine group was given acetylcysteine 50mg/（kg·d），and 3 days consecutively. 1 hour after the last time，the acute liver failure model was reproduced in rats by peritoneal injection of D-Galactosamine（D-GalN）and lipopolysaccharide（LPS）. After 6 hours，the liver tissue of rats were taken out for Western Blot assay of Bcl-2 and Caspase-3 protein expressions，and TNF-α，IL-6，IL-10 in serum were detected by immunohistochemistry. Result Compared with the normal group，Bcl-2 protein expressions were signif i cantly decreased in the liver tissue of model group，and Caspase-3 protein expressions were significantly increased，the TNF-α、IL-6、IL-10 in serum were same to（P＜0.05）. Compared with the model group，Caspase-3 protein expressions and TNF-α，IL-6，IL-10 in the group of smilax prescription and acetylcysteine were signif i cantly down-regulated，while Bcl-2 protein expressions were signif i cantly up-regulated（P＜0.05）. Compared with the acetylcysteine group，Caspase-3 protein expressions and TNF-α，IL-6，IL-10 in the group of smilax prescription were slightly up-regulated，Bcl-2 protein expressions were slightly down-regulated（P＞0.05）.Conclusion Smilax prescription has protective effect on the apoptosis of rats with acute liver failure，and its possible mechanism may be related to up-regulated of Bcl-2 protein expressions，downregulated of Caspase-3 protein expressions to and intervention proinf l ammatory cytokines and anti-inf l ammatory cytokines.

Acute liver failure Apoptosis Smilax prescription Inf l ammatory cytokines Rat

310053 浙江中医药大学（郭秋芳 郭意男）322000 浙江大学医学院附属第四医院（赵康路）310018 浙江省中医院（叶卫江）

*通信作者800mg/kg，肉毒素脂多糖（LPS）10μg/kg腹腔注射，一次性造成大鼠ALF模型。

1.5 标本采集 造模6h后，所有大鼠10%水合氯醛3.0ml/kg腹腔注射麻醉，迅速心脏采血。采血后立即处死大鼠，沿腹中线剪开取大鼠肝左叶相同部位组织，部分用等渗冰生理盐水冲洗后锡纸包裹放入-80℃冰箱中保存，以便制备肝组织均浆；部分用10%福尔马林溶液固定后进行石蜡包埋、切片。

1.6 标本检测 （1）血清生化指标及促炎因子：心脏采血2ml，离心取血清，采用全自动生化分析仪器检测血清AST、ALT和TBIL含量；采用ELISA法检测检测TNF-α、IL-6、IL-10含量，操作步骤按试剂盒说明。（2）肝组织Bcl-2和Caspase-3蛋白表达的检测：肝脏组织冰上降温，均浆器制备，离心取上清液，采用Western Blot实验方法提取Bcl-2和Caspase-3蛋白，操作步骤按试剂盒说明。

1.7 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件。计量资料以（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。