玉米粉中吡虫啉、三唑酮、乙草胺与异丙甲草胺的QuEChERS/高效液相色谱-串联质谱快速检测

李菊颖，郭欣妍，何 健，吴文铸，孔德洋，单正军，陈全博

(环境保护部南京环境科学研究所 国家环境保护农药环境评价与污染控制重点实验室，江苏 南京 210042)



玉米粉中吡虫啉、三唑酮、乙草胺与异丙甲草胺的QuEChERS/高效液相色谱-串联质谱快速检测

李菊颖，郭欣妍，何 健，吴文铸*，孔德洋，单正军，陈全博

(环境保护部南京环境科学研究所 国家环境保护农药环境评价与污染控制重点实验室，江苏 南京 210042)

建立了玉米粉中吡虫啉、三唑酮、乙草胺和异丙甲草胺4种常用农药的QuEChERS/高效液相色谱-串联质谱残留分析方法。前处理采用QuEChERS方法，以乙腈为提取剂，N-丙基乙二胺(PSA)和石墨化碳黑(GCB)为分散净化剂，并利用高效液相色谱-串联质谱在多反应离子监测模式(MRM)下进行检测，基底匹配工作曲线法定量。结果表明：4种农药在0.005～1.000 mg/L浓度范围内均具有良好的线性关系(r2≥0.998)；在0.05～1.00 mg/kg加标水平下的平均回收率为74.9%～98.4%，相对标准偏差(n=5)为1.6%～5.3%；方法检出限(LOD)为0.001～0.26 μg/kg；定量下限(LOQ)为0.004～0.867 μg/kg。该方法分析速度快、灵敏度高、重现性好，适用于玉米粉中吡虫啉、三唑酮、乙草胺和异丙甲草胺4种农药残留的快速检测和确证。

QuEChERS；吡虫啉；三唑酮；乙草胺；异丙甲草胺；高效液相色谱-串联质谱法

吡虫啉(Imidacloprid)、三唑酮(Triadimefon)、乙草胺(Acetochlor)和异丙甲草胺(Metolachlor)是玉米田常用的4种农药。吡虫啉是烟碱类超高效杀虫剂，主要用于防治刺吸式口器害虫；三唑酮是一种高效低毒的三唑类杀菌剂，多用于防治黑穗病、锈病和白粉病等；乙草胺、异丙甲草胺分别是选择性芽前处理除草剂和广谱性播后苗前除草剂，主要用于防除禾本科杂草和部分阔叶杂草。国标GB 2763-2016中规定[1]，玉米中吡虫啉的最大残留限量(MRL)为0.05 mg/kg，乙草胺为 0.05 mg/kg，异丙甲草胺为 0.1 mg/kg，三唑酮为 0.5 mg/kg。

目前，国内这4种农药的相关检测方法主要有气相色谱法[2-3]、高效液相色谱法[4-5]、气相色谱-质谱联用法[5-11]和高效液相色谱-串联质谱法[12-17]。国内也建立了粮谷中486种农药及相关化学品残留量测定的液相色谱-质谱法[18]和475种农药及相关化学品残留量测定的气相色谱-质谱法[19]，但这些方法样品处理过程较复杂，且提取过程使用了毒性较大的甲苯及二氯甲烷，检出限偏高，不能很好地满足痕量多残留的快速检测需求。本研究在前人基础上，建立了这4种农药在玉米粉中的分散固相萃取(QuEChERS)/高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)残留分析方法。本方法前处理简单、成本较低、抗干扰能力强、定性定量分析灵敏度高、重现性好，可用于玉米粉中吡虫啉、三唑酮、乙草胺和异丙甲草胺的快速检测和确证。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

ACQUITYTM超高效液相色谱仪-Quattro Premier XE 质谱仪(美国Waters 公司)，MS105DU电子天平(瑞士MettlerToledo公司)，高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司)，KQ-500DB型数控超声仪(昆山超声仪器有限公司)。吡虫啉、三唑酮、乙草胺、异丙甲草胺(纯度均为99.0%)均购自德国Dr.Ehrenstorfer GmbH；乙腈、甲酸(色谱纯，德国Merck公司)，无水硫酸镁(分析纯，西陇化工股份有限公司)，PAS(美国Agilent Technologies)，GCB(美国Waters公司)。有机玉米粉购自当地市场。

1.2 样品的提取与净化

1.3 UPLC-MS/MS检测条件

1.3.1 液相色谱条件 色谱柱为UPLC BEH C18柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；柱温：30 ℃；进样体积：2 μL；运行时间：5 min；流动相：A为0.01%甲酸溶液，B为乙腈；流速为300 μL/min；梯度洗脱程序：0～0.5 min，95%A；0.5～2 min，95%～5%A；2～3 min，5%A；3～4 min，5%～95%A；4～5 min，95%A。

1.3.2 质谱条件 电喷雾离子源(ESI)，离子源温度为120 ℃，脱溶剂温度为380 ℃，脱溶剂气和锥孔气为氮气，脱溶剂气流速为500 L/h，锥孔气流速为50 L/h，碰撞气为高纯氩气，采用多反应监测模式(MRM)检测。ESI-MS/MS 选择性反应正离子检测，检测离子和各子离子的碰撞能量见表1。

表1 待测农药的质谱检测条件

1.4 标准溶液的配制及标准曲线的绘制

准确称取吡虫啉、三唑酮、乙草胺和异丙甲草胺，分别配制1 000 mg/L的储备液，并用乙腈进行稀释配制成100 mg/L的吡虫啉、三唑酮、乙草胺和异丙甲草胺混合标准液，备用。将空白有机玉米粉按“1.2 ” 方法处理得到空白基质，分别配制成 0.005，0.01，0.02，0.05，0.1，0.2，0.5，1.0 mg/L的混合基质匹配标准溶液。在上述分析条件下进样，测定各组分的定量离子对强度。以各农药的定量离子峰面积(y)为纵坐标，其质量浓度(x，mg/L)为横坐标绘制标准曲线，得到4种农药的线性方程及相关系数(r2)。

1.5 加标回收试验

称取5.0 g空白玉米粉样品，设置0.05，0.5，1.0 mg/kg 3个加标水平，分别加入对应量的混合标准溶液，混匀，每个浓度水平平行处理5份(n=5)，进行回收试验，计算平均回收率和相对标准偏差(RSD)。

2 结果与讨论

2.1 检测条件的优化

(1)智能发育：采用GDS评分评价患儿智能发育情况，分别从语言、适应性、精细动作、个人社交、大运动5个方面进行评分，评分越高表明智能发育越好。(2)社会适应能力：采用儿童适应行为能力量表(America Association of Mental Deficit-Adaptive Behavior Scale，AAMD-ABS)对患儿干预前及干预6个月后的社会适应能力进行评价，分别从认知功能因子、独立功能因子、社会/自制因子3个方面进行评价，评分越高表明社会适应能力越好。

在电喷雾质谱、正负离子监测模式下，分别对毛细管电压、锥孔电压、碰撞能量和选择离子等进行优化，选取经碰撞后所得丰度较高的两个子离子作为定量和定性离子，并确定最佳碰撞能量的电压值。最终所选择的母离子、子离子和碰撞能量等参数见表1。4种农药玉米粉基质标准溶液的多反应监测模式定量离子色谱图见图 1。

2.2 提取溶剂的选择

采用乙腈和甲酸酸化乙腈作为萃取溶剂，研究两种溶剂的提取效果。对比发现，当甲酸-乙腈的体积比为1∶100时，干扰物质少，4种农药的回收率高，因而实验选择1%甲酸酸化乙腈溶液作为提取溶剂。

2.3 提取时间的选择

实验对提取时间进行了优化，对玉米粉加标样品分别超声提取10，20，30，40 min，考察其提取效率的变化。结果显示，4种提取时间下，农药在玉米粉中的回收率分别为65.2%～84.7%，74.1%～96.1%，75.4%～96.8%和76.3%～97.5%，除提取时间10 min时的回收率略低外，其余提取时间无明显差异。为保证提取效率、缩短提取时间、减弱基质干扰，实验选取提取时间为20 min。

2.4 净化条件的选择

QuEChERS前处理过程中固相吸附剂对待测农药的吸附会导致回收率降低，进而影响检测结果的准确性。本文研究了吸附剂PSA和GCB对4种杀虫剂的吸附效果。PSA作为净化材料，其表面键合的氨基作为有效成分，对样品中的金属离子、糖类、脂肪酸、亲脂性色素等极性物质具有良好的净化作用，但对色素的净化能力不理想。GCB对色素有较强的吸附净化能力，但由于其表面的六元环结构会吸附一些平面及对称结构的农药，导致回收率降低。因而，本文对净化过程中GCB的用量进行了优化，在加标水平为0.5 mg/kg时，分别选择0.15 g无水硫酸镁和0.05 g PSA，考察了GCB用量分别为0.01，0.02，0.03，0.04 g时的净化能力。结果表明，在上述4种用量下，提取液均澄清透明，但随着GCB用量的增多，4种农药的回收率不同程度下降，其中异丙甲草胺在GCB用量为0.04 g 时的回收率低于60%。为获得最佳净化效果，本实验选择GCB用量为0.01 g。

2.5 基质效应

基质效应的计算方法一般为：基质效应=(1-基质匹配标准曲线的斜率/溶剂标准曲线的斜率)×100%。结果表明：玉米粉作为基质时，吡虫啉、三唑酮、乙草胺和异丙甲草胺的基质效应分别为12%，22%，18%和26%，其中三唑酮和异丙甲草胺的基质效应>20%，对定量检测具有显著影响，不可忽略[17]。故本文选择基质匹配标准曲线进行定量分析，以抵消基质效应的影响。

2.6 线性范围与灵敏度

根据“1.4”所述方法配制0.005～1.000 mg/L系列基质标准工作液，绘制标准曲线，结果见表2。结果表明吡虫啉、三唑酮、乙草胺、异丙甲草胺在0.005～1.000 mg/L范围内具有良好的线性关系(r2≥0.998)。根据信噪比S/N≥3和S/N≥10分别确定方法检出限(LOD)和定量下限(LOQ)，计算得吡虫啉、三唑酮、乙草胺和异丙甲草胺的LOD分别为0.04，0.02，0.26，0.001 μg/kg；LOQ分别为0.13，0.077，0.867，0.004 μg/kg。而国标GB 20770-2008[1]中吡虫啉、三唑酮、乙草胺和异丙甲草胺的LOD分别为11.0，3.94，23.70，0.2 μg/kg，均高于本方法。

表2 4种农药的线性关系、平均加标回收率及相对标准偏差(n=5)

2.7 回收率与精密度

按“1.5”所述方法进行加标回收试验，结果见表2。在 0.05～1.00 mg/kg 3 个加标水平下，4种待测物的平均回收率为74.9%～98.4%，相对标准偏差(RSD)为1.6%～5.3%。方法的准确度均满足农药定量分析要求，可应用于玉米粉中4种农药的测定。

图2 阳性样品中三唑酮的MRM定量离子色谱图Fig.2 MRM chromatogram of triadimefon in a positive sample

2.8 实际样品的测定

为研究市场在售玉米粉的农药残留现状，收集10余份玉米粉样品进行实际样品检测，结果在其中1批玉米粉样品中检出三唑酮，含量为78.7 μg/kg。依照国标GB 2763-2016中规定，玉米中三唑酮的最大残留限量(MRL)为0.5 mg/kg，该阳性样品未超过限量要求。阳性样品的MRM 图如图2所示。

3 结 论

本文采用QuEChERS/高效液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)方法，建立了玉米粉中吡虫啉、三唑酮、乙草胺和异丙甲草胺4种常用农药的快速检测方法。该方法平均回收率为74.9%～98.4%，RSD为1.6%～5.3%；方法LOD为0.001～0.26 μg/kg，LOQ为0.004～0.867 μg/kg。该方法具有简便快捷、重复性好、准确度高等特点，适用于玉米粉中农药的快速检测和确证。

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Rapid Determination of Imidacloprid,Triadimefon,Acetochlor and Metolachlor in Corn Flour by QuEChERS/Ultra-performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

LI Ju-ying,GUO Xin-yan,HE Jian,WU Wen-zhu*,KONG De-yang,SHAN Zheng-jun,CHEN Quan-bo

(Nanjing Institute of Environmental Science,Key Laboratory of Pesticide Environmental Assessment and Pollution Control,Ministry of Environmental Protection of the People’s Republic of China,Nanjing 210042,China)

A QuEChERS/HPLC-MS/MS method was developed for the simultaneous determination of imidacloprid,triadimefon,acetochlor and metolachlor residue in corn flour.The residues were extracted from samples with acetonitrile and cleaned up by dispersive method using PSA and GCB，then detected by high liquid chromatography-mass spectrometry(HPLC-MS/MS) under multiple reaction monitoring mode,and quantified by the matrix-matched standard solution.The results showed the method had a good linearity(r2≥0.998) in the range of 0.005-1.000 mg/L.Average recoveries at three spiked levels of 0.05-1.00 mg/kg were in the range of 74.9%-98.4%with relative standard deviations(n=5) of 1.6%-5.3%.The limits of detection(LOD) for 4 pesticides were in the range of 0.001-0.26 μg/kg，and limits of quantitation(LOQ) were in the range of 0.004-0.867 μg/kg.With the advantages of rapidness，simplicity，high sensitivity and good reproducibility,the method is suitable for the determination of target pesticides in corn flour.

QuEChERS;imidacloprid;triadimefon;acetochlor;metolachlor;HPLC-MS/MS

2017-01-11；

2017-02-26

国家重点研发计划(2016YFD0200200,2016YFD0200201)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.06.014

O656.63；F767.2

A

1004-4957(2017)06-0783-05

*通讯作者：吴文铸，副研究员，研究方向：农产品质量安全，Tel：025-87657202，E-mail：wwz@nies.org