神经保护剂3β，5α，6β-雄甾三醇原料药中3种非对映异构体的分离与含量测定

谢敏玉，王亚龙，李心花，熊 丽，文 慧，胡海燕，张静夏*

(1.中山大学 药学院，广东 广州 510006； 2.广州市赛普特医药科技股份有限公司，广东 广州 510663)



神经保护剂3β，5α，6β-雄甾三醇原料药中3种非对映异构体的分离与含量测定

谢敏玉1，2，王亚龙1，李心花1，熊 丽2，文 慧2，胡海燕1，张静夏1*

(1.中山大学 药学院，广东 广州 510006； 2.广州市赛普特医药科技股份有限公司，广东 广州 510663)

建立了分离与测定3β，5α，6β-雄甾三醇(YC-6)原料药中3种非对映异构体的气相色谱方法。进行了分离条件的优化及方法学验证。研究结果表明：该方法可对YC-6与各非对映异构体进行分离，专属性良好(分离度≥1.5)，精密度高(RSD≤2.0%)；YC-6在6.0～30.0 mg/L质量浓度范围内线性关系良好。测定了非对映异构体的响应因子(1.59，1.32 和1.41)，并采用加校正因子的主成分自身对照内标法以峰面积计算各非对映异构体的含量。该方法操作简便，结果准确，可用于YC-6原料中各非对映异构体的分离及含量测定。

3β，5α，6β-雄甾三醇；非对映异构体；含量测定；气相色谱(GC)

脑卒中是严重威胁人类生命健康的重大疾病，神经保护剂是脑卒中防治的重要研究领域，神经甾体类活性化合物有望成为一类新的神经元保护剂[1-5]。3β，5α，6β-雄甾三醇(YC-6)及类似物在多种动物和细胞水平的神经损伤模型上表现出显著的神经元保护效果[6-7]，是非常有应用前景的神经元保护剂，目前正在进行临床Ⅰ期试验。YC-6是以去氢表雄酮为原料，通过17-位羰基的黄鸣龙反应、甲酸/H2O2体系氧化和碱解反应获得[7]；该合成过程中，5，6位的2个手性碳由潜手性的5，6位双键转化所得，理论上会得到4个手性光学异构体；由于目标产物含有8个手性碳，其中6个手性碳和起始原料去氢表雄酮的构型一致，理论上，YC-6和3个光学异构体之间的关系为非对映异构体，其结构如图1所示。

图1 YC-6及3个非对映异构体的结构

YC-6作为国内自主研发的1.1类抗脑卒中新药，尚无文献报道该化合物中非对映异构体的检测方法。在新药研发过程的质量控制研究中，光学异构体的分离检测是药物研发的关键技术问题，虽然已有许多文献报道一些药物的光学异构体的检测方法[8-15]，但由于每类化合物的结构特殊性，导致获得简便而高效的光学异构体的分析方法仍是药物研发过程中亟需解决的瓶颈问题。本研究拟采用气相色谱法实现YC-6与非对映异构体的分离与含量测定，以期为YC-6原料药中非对映异构体的杂质检查提供一个简便而有效的实验方法，相关研究对其进一步临床试验及生产中非对应异构体含量的控制具有重要意义。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

7890A GC System气相色谱仪(美国Agilent公司)，含FID 检测器；色谱柱：Agilent DB-5MS(30 m×250 μm×0.25 μm)，XS205 型电子分析天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)，SK5200H 超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司) 。

3β，5α，6β-雄甾三醇原料药(简称YC-6，批号：101030，110214，110225，110228，110620，110622，110629)，3β，5α，6β-雄甾三醇对照品(批号：100913，纯度为99.60%，1H NMR(DMSO)，δ：4.40，4，16，3.80，3.65，3.30，1.86-1.03，0.88，0.67)。

非对映异构体-Ⅰ对照品 (简称异构体-Ⅰ，化学名为3β，5β，6β-雄甾三醇，1H NMR(DMSO)，δ：5.03，4.79，4.04，3.96-3.89，3.34，1.89-0.99，0.98-0.88，0.67)。

非对映异构体-Ⅱ对照品(简称异构体-Ⅱ，化学名为3β，5β，6α-雄甾三醇，1H NMR(DMSO)，δ：5.16，4.65，4.04，4.00，3.55-3.46，1.79-0.86，0.81，0.65)。

非对映异构体-Ⅲ对照品(简称异构体-Ⅲ，3β，5α，6α-雄甾三醇，1H NMR(DMSO)，δ：5.33，5.08，4.39，4.06，2.16-2.17，1.75-1.20，1.10，0.69)。

以上样品均由本实验室自制，内标物黄体酮购自中国药品生物制品检定所，批号：027-8004。

1.2 溶液的配制

1.2.1 对照品溶液 分别取适量YC-6、异构体-Ⅰ、异构体-Ⅱ及异构体-Ⅲ，用乙腈溶解并稀释成每1 mL中约含10 μg样品的对照溶液。

1.2.2 校正因子测定溶液 分别取适量异构体-Ⅰ、异构体-Ⅱ及异构体-Ⅲ，各加入适量YC-6，用乙腈溶解并稀释成每1 mL中约含10 μg异构体及YC-6的对照溶液。

1.2.3 系统适用性溶液 适量YC-6对照品、异构体-Ⅰ、异构体-Ⅱ、异构体-Ⅲ及黄体酮(内标)，用乙腈溶解并稀释成每 1 mL含YC-6对照品 2 mg，异构体-Ⅰ、异构体-Ⅱ、异构体-Ⅲ及黄体酮各约10 μg的混合溶液。

1.2.4 供试品溶液与0.5%对照溶液 取YC-6原料药的粉末适量，精密加入内标溶液(100 mg/L)，加入乙腈使其溶解并稀释至刻度，摇匀，配成每1 mL含YC-6约2 mg和黄体酮约10 μg的供试品溶液；取对照品溶液适量，精密加入内标溶液(100 mg/L)，用乙腈稀释成每1 mL中约含10 μg YC-6和10 μg 黄体酮的溶液作为0.5%对照溶液。

1.3 分析方法

以5%苯基-95%聚二甲基硅氧烷为固定液的毛细管柱为色谱柱(DB-5MS：30 m×250 μm×0.25 μm毛细管柱适用)；程序升温：起始温度为220 ℃，以10 ℃/min升至270 ℃保持24 min；检测器为氢火焰离子化检测器(FID)，检测器温度为280 ℃；进样口温度为280 ℃，分流进样，分流比为10∶1；载气为氮气，流速为0.5 mL/min。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

2.1.1 色谱柱的优化 分别考察了HP-5,DB-1701,DB-5MS 3种型号毛细管柱对主峰与各非对映异构体分离度的影响，起始温度220 ℃，以10 ℃/min升至270 ℃保持10 min，氮气流速均为1 mL/min。

研究结果显示，HP-5，DB-1701与DB-5MS柱上，主成分与相邻的非对映异构体之间的分离度分别为1.51，1.25和1.95。HP-5与DB-5MS两种色谱柱上，YC-6与各非对映异构体的分离度均符合要求。但DB-5MS的色谱分离中，主峰与其之前的峰具有更好的分离度，因此选择DB-5MS色谱柱考察条件下各峰的分离度为12.43，2.93和1.47。

2.1.2 进样口温度的优化 GC法能否作为YC-6中各异构体的检查方法的首要条件是，进样时YC-6及其异构体能否气化、气化是否完全以及各物质是否发生分解。取“1.2.3”配制的系统适用性溶液，采用“1.3”方法，考察其在不同进样口温度(220，260，280 ℃)下样品的检出情况(面积归一化法计算各峰的百分含量)。

研究结果显示，不同进样口温度对YC-6的峰面积及百分峰面积的检出基本一致，其相对标准偏差(RSD)分别为1.9%和0.3%，均小于2.0%；但对于3个非对映异构体，其峰面积及百分峰面积的检出，RSD值均大于5.0%；初步判断当进样口温度为220 ℃时，样品未完全气化。从YC-6及各异构体的峰面积、百分峰面积、峰形、分离度方面进行分析，发现在进样口温度280 ℃下，YC-6及各异构体的气化完全且稳定，故选择进样口温度为280 ℃。

2.1.3 柱温的优化 在气相色谱法中，不同的柱温影响待测物质的分离。取“1.2.3”配制的系统适用性溶液，采用“1.3”分析方法，考察了不同柱温条件下YC-6与各异构体的分离效果，实验结果见表1。研究显示，3种程序升温方式中，YC-6与异构体-Ⅲ之间的分离度均符合要求。综合考虑，选择条件1的色谱条件进行考察，即起始温度为220 ℃，以10 ℃/min升至270 ℃，保持24 min。

表1 不同柱温下样品中各色谱峰之间的分离度(R)

2.1.4 供试品浓度的筛选 非对映异构体能否被检出，除了色谱条件外，供试品溶液的浓度能否达到其检测灵敏度也很重要。考察了供试品溶液质量浓度(0.5，1.0，2.0 mg/mL)的影响，结果显示，进样2 mg/mL的供试品溶液，能检出0.05%以下的杂质，故选择供试品溶液的质量浓度为2 mg/mL。

2.2 方法学验证

2.2.1 专属性 分别取4个对照品溶液和系统适用性溶液各1 μL，注入气相色谱仪，按照“1.3”方法测定，记录色谱图。结果表明，YC-6与异构体-Ⅰ、异构体-Ⅱ、异构体-Ⅲ及黄体酮(内标)均能有效分离，YC-6与峰前异构体-Ⅲ的分离度大于1.5，符合分离要求。表明本方法专属性良好，适用于YC-6及其非对映异构体的测定，色谱分离结果见图2。

图2 专属性色谱图Fig.2 Chromatogram of method specificity 1.3β，5β，6β-androstriol，2.3β，5α，6α-androstriol，3.3β，5α，6α-androstriol，4.YC-6，5.progesterone

2.2.2 检出限 取 YC-6 对照品溶液及异构体-Ⅰ、异构体-Ⅱ、异构体-Ⅲ对照品溶液用乙腈分别逐步稀释，取稀释溶液按照“1.3”方法测定。以 3倍信噪比(S/N=3)计算，得YC-6、异构体-Ⅰ、异构体-Ⅱ和异构体-Ⅲ的检出限分别为1.0，2.5，2.0，2.0 mg/L。

2.2.3 定量下限 取 YC-6 对照品溶液及异构体-Ⅰ、异构体-Ⅱ和异构体-Ⅲ对照品溶液，用乙腈分别逐步稀释，取稀释溶液进样分析。以10倍信噪比(S/N=10)计算，得到YC-6、异构体-Ⅰ、异构体-Ⅱ及异构体-Ⅲ的定量下限分别为5.07,6.96,6.44,6.00 mg/L。

2.2.4 相对校正因子 取“1.2.2”的校正因子测定溶液各1 μL，注入气相色谱仪，按照“1.3”方法测定，连续进样6次，记录色谱图。经计算，异构体-Ⅰ、异构体-Ⅱ、异构体-Ⅲ对YC-6的相对校正因子分别为1.59，1.32，1.41。结果表明，各异构体对主成分的相对校正因子均在0.9～1.1范围之外，不适宜直接采用主成分的自身对照法计算异构体含量，本文采用加校正因子的主成分自身对照内标法以峰面积计算异构体的含量。

2.2.5 线性关系 取YC-6对照品适量，精密称定，用乙腈溶解并稀释成6.0，10.0，16.0，20.0，30.0 mg/L 的 YC-6 梯度对照品溶液(含10 mg/L的内标)。精密量取上述溶液各1 μL，分别注入气相色谱仪，按照“1.3”方法测定，记录色谱图。以YC-6的浓度(ρ，mg/L)对YC-6与内标的峰面积比(A/A0)进行线性回归，得回归方程为A/A0=0.093 8ρ-0.033 8(r2=0.999 6)。结果表明，YC-6在6.0 ～30.0 mg/L质量浓度范围内与峰面积比呈良好的线性关系。

2.2.6 进样精密度试验 取“1.2.3”的0.5%对照溶液，精密量取1 μL注入气相色谱仪，按照“1.3”方法测定，重复进样6次，记录色谱图。以YC-6与黄体酮的浓度和峰面积计算校正因子，6次测定结果平均校正因子的RSD(n=6) 为0.7%，表明对照品溶液的进样精密度良好，符合测定要求。

2.2.7 重复性试验 称取YC-6样品6份，精密称定，分别精密加入内标溶液(100 mg/L)，加乙腈使之溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1 mL含YC-6约2 mg和含黄体酮约10 μg的供试品溶液。精密量取该供试品溶液1 μL，注入气相色谱仪，按照“1.3”方法测定，记录色谱图。采用主成分自身对照内标法计算含量，主峰YC-6的含量为99.16%，RSD为0.01%；各异构体含量的RSD均小于2.0%。表明本法的重复性良好，各异构体测定的精密度良好，符合测定要求。

2.2.8 溶液稳定性试验 取“1.2.4”的供试品溶液，分别于0，2，4，8，9，12 h 精密量取1 μL，注入气相色谱仪，按“1.3”方法测定，记录色谱图，采用主成分自身对照内标法计算含量。结果显示，主峰YC-6的RSD (n=6 )为0.2%，各异构体峰的RSD (n=6 )均不大于2.0%，表明供试品溶液在12 h 内稳定。

2.3 样品中异构体的含量测定

精密量取0.5%对照溶液1 μL，注入气相色谱仪；取供试品溶液1 μL注入气相色谱仪，记录色谱图至主成分色谱峰保留时间的2倍。供试品溶液的色谱图中如检测出异构体峰，按加校正因子的主成分自身对照内标法以峰面积计算异构体的含量。利用该分析方法，对合成的6批YC-6样品进行测定，结果显示，6批样品中均未检出异构体-Ⅰ和异构体-Ⅱ，而异构体-Ⅲ的含量均低于0.10%。

3 结 论

本文建立了气相色谱法分离和测定YC-6原料药中非对映异构体的方法。该方法灵敏度高、重现性好、简单方便、检测成本低，能够满足临床试验及工业化生产中YC-6原料药中非对映异构体的分离及含量检测要求。

[1] Karsy M，Brock A，Guan J，Taussky P，Kalani M Y，Park M S.Neurosurg.Focus，2017,42(4)：E3.

[2] Zhang F，Wang S，Signore A P，Chen J.Stroke， 2007，38：2329- 2336.

[3] Ishihara Y，Kawami T，Ishida A.SteroidBiochem.Mol.Biol.， 2013,135：1-6.

[4] Tsutsui K.J.Mol.Neurobiol.，2008,37(2)：116.

[5] Hubert V,Jean-Luc D R,Delphine B,Van L T,Georges P,David V,Kazuyoshi T.J.Front.Endocrinol.，2011,2：79.

[6] Chen J，Leng T，Chen W，Yan M，Yin W，Huang Y，Lin S，Duan D，Lin J，Wu G，Zhang J，Yan G.Steroids，2013,78：996-1002.

[7] Yan M，Liu A L，Zhou S J，Tang L P，Ou Y Q，Yin W，Chen X Y，Su X W，Qiu P X，Huang Y J，Zhang J X，Yan G M，Leng T D.CNSNeurosci.Ther.，2015,21(6)：486-495.

[8] Leng T D，Liu A M，Wang Y Q，Chen X Y，Zhou S J，Li Q，Zhu W B，Zhou Y，Su X W，Huang Y J，Yin W，Qiu P X，Hu H Y，Xiong Z G，Zhang J X，Yan G M.Steroids,2016,105：96-105.

[9] Zhang F，Yang Z Q，Wang X L.Chin.J.Pharm.Anal.(张芳，杨志强，王杏林.药物分析杂志)，2013,33(2)：189-192.

[10] Cui P，Ji A C，Zhang A H，Ding Y M.Chin.J.Pharm.( 崔萍，纪安成，张爱华，丁逸梅.中国医药工业杂志)，2015,46(11)：1220-1222.

[11] Wang D W，Wang X N，Feng M J，Song Y X.J.Instrum.Anal.(王东武，王西宁，丰梅君，宋莹雪.分析测试学报)，2014, 33 (10)：1123-1128.

[12] Wang N，Zhang L T，Gu J M，Liu M，Zhu H.Chin.J.Pharm.(王娜，张兰桐，谷建敏，刘曼，朱红.中国医药工业杂志 )，2010,41(7)：528-530.

[13] Ye X X，Song Y X，Chen X T，Ji Y Z，Sun L L，Wu X Q，Du C Y.J.Instrum.Anal.(叶祥喜，宋燕西，陈旭涛，季有知，孙璐璐，吴小倩，杜春燕.分析测试学报)，2014,33(4)：471-474.

[14] Cao Z G，Li L S，Cheng B P，Zhang H F，Zeng C，Qiao T.J.Instrum.Anal.(曹志刚，李来生，程彪平，张宏福，曾春，谯婷.分析测试学报)，2016,35(1)：16-22.

[15] Yang L P，Wang L X，Xu Y L，Qian B Y，Gao R Y.J.Instrum.Anal.(杨丽萍，王立新，徐艳丽，钱宝英，高如瑜.分析测试学报)，2004,23(5)：25-28.

Separation and Determination of Three Diasteromers in Neuroprotectant 3β，5α，6β-Androstriol Bulk Drug

XIE Min-yu1，2，WANG Ya-long1，LI Xin-hua1，XIONG Li2，WEN Hui2，HU Hai-yan1，ZHANG Jing-xia1*

(1.School of Pharmaceutical Sciences，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510006，China；2.Guangzhou Cellprotek Pharmaceutical Co.，Ltd.，Guangzhou 510663，China)

A GC method for the separation and determination of three diasteromers in neuroprotectant 3β，5α，6β-androstriol(YC-6) bulk drug was developed.The separation conditions such as column type，injection port temperature，column temperature and sample concentrate were optimized，and method validation was developed.The results showed that the method had a good specificity(resolution(R) ≥1.5) and a good precision(RSD≤2.0%，n=6).The calibration curve showed a good linearity over the concentration range of 6.0-30.0 μg/mL for YC-6.The response factors of three diasteromers were 1.59，1.32 and 1.41，respectively，and their contents were detected by principal component self-comparison with calibration factor and internal standard method.The method was simple，sensitive and valid，and was successfully applied in the analysis of diasteromers in neuroprotectant 3β，5α，6β-androstriol bulk drug.

3β，5α，6β-androstriol; diasteromers; content determination; gas chromatography(GC)

2017-02-04；

2017-03-28

广东省重大科技专项(2012A080201008)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.06.020

O657.71;TQ460.72

A

1004-4957(2017)06-0812-05

*通讯作者：张静夏，博士，副教授，研究方向：新药研究与开发，Tel：020-39943063，E-mail：jingxiaz@163.com