携带cRGD肽的靶向纳米粒超声造影剂的制备以及体外寻靶实验研究

宣吉晴，陈瑜莉，敖 梦,2*，王志刚,2，郑元义,2,3，汪朝霞，李 奥

(1.重庆医科大学附属第二医院超声分子影像学重庆市重点医学实验室，重庆 400010；2.重庆医科大学附属第二医院超声科，重庆 400010；3.上海交通大学附属第六人民医院超声科，上海 200233；4.重庆医科大学附属儿童医院超声科，重庆 400016；5.南京医科大学第一附属医院超声科；江苏 南京 210029)

携带cRGD肽的靶向纳米粒超声造影剂的制备以及体外寻靶实验研究

宣吉晴1，陈瑜莉1，敖 梦1,2*，王志刚1,2，郑元义1,2,3，汪朝霞4，李 奥5

(1.重庆医科大学附属第二医院超声分子影像学重庆市重点医学实验室，重庆 400010；2.重庆医科大学附属第二医院超声科，重庆 400010；3.上海交通大学附属第六人民医院超声科，上海 200233；4.重庆医科大学附属儿童医院超声科，重庆 400016；5.南京医科大学第一附属医院超声科；江苏 南京 210029)

目的 制备携带精-甘-天冬氨酸(cRGD)肽的聚乳酸/羟基乙酸(PLGA)纳米粒超声造影剂，观察其在体外对大鼠肝星状细胞(HSC)的靶向能力。方法 以PLGA-COOH和全氟新溴烷(PFOB)为原料，采用双步乳化法制备PLGA-PFOB纳米粒，采用光学显微镜、扫描电镜以及透射电镜观察其表面以及内部结构；采用马尔文粒径分析仪测量其粒径大小、分布以及表面电位；通过碳二亚胺法连接cRGD肽制备靶向纳米粒超声造影剂(cRGD-NPs)，用激光共聚焦显微镜以及流式细胞仪检测PLGA-PFOB纳米粒造影剂与cRGD肽的连接情况；在大鼠HSC中验证该造影剂的靶向性能。结果 所得样品为乳白色混悬液，纳米粒大小均匀，粒径分布较窄，平均粒径(255.3±66.8)nm，多分散指数为0.025，Zeta电位为(-16.4±5.1)mV；扫描电镜示纳米粒表面光滑规则、透射电镜示PLGA外壳里包裹液氮氟碳PFOB；共聚焦显微镜观察到连接FITC-cRGD显示为绿色，与显示红色的纳米粒共同融合成橙色，靶向纳米粒超声造影剂大量向大鼠HSC聚集并被其吞噬，红色荧光强度明显多于普通非靶向造影剂。结论 成功制备的携带cRGD肽的纳米粒超声造影剂，在体外实验中对大鼠HSC有较强的特异性亲和力。

靶向；纳米粒；超声检查；造影剂

超声靶向分子成像技术是一种将影像技术与分子生物学相结合的新技术，近年来纳米靶向超声造影剂的制备和应用备受关注。纳米级超声造影剂较常规微泡超声造影剂粒径更小，可穿过血管内皮细胞进入组织间隙，使血管外靶向组织显像[1-2]。肝纤维化在全球范围内有较高的发病率和死亡率[3]，是各种慢性肝病向肝硬化发展的必经阶段。肝星状细胞(hepatic stellate cells, HSC)的活化和增生是肝纤维化发生、发展的中心环节，在肝纤维化形成中起着关键作用。HSC活化后转化为纤维母细胞样，合成大量以Ⅰ型胶原蛋白为主的细胞外基质。而黏附分子家族中的整合素有可识别细胞外基质特性的氨基酸序列[精-甘-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp，RGD)序列，即RGD肽][4]，参与HSC活化的多个环节，参与细胞和细胞外基质、细胞和细胞间的黏附。本实验旨在制备一种可携带含RGD序列的环八肽(cRGD)的纳米级超声造影剂，探讨其体外结合大鼠HSC的特性。

1 材料与方法

1.1主要仪器与试剂 光学显微镜(IX71，Olympus，日本)；激光共聚焦显微镜(A1R，Nikon，日本)；马尔文粒径分析仪(Zeta SIZER 3000HS，英国)；流式细胞仪(FACS-calibur，美国)；声振仪(Sonics & Materials，美国)；羧基端乳酸/羟基乙酸共聚物(PLGA-COOH，分子量12000，聚合比50∶50)；全氟新溴烷(PFOB；TCI，日本)；FITC标记环八肽cRGD(序列为C*GRGDSPC*，中国强耀生物有限公司)；EDC/souf-NHS、荧光染料尼罗红、DAPI(Sigma公司，美国)；MES缓冲液；Gibco EMDM高糖培养基；大鼠肝细胞细胞株(BRL-3A)和大鼠肝星状细胞细胞株(HSC-T6；武汉普诺赛生命科技有限公司细胞库)。

1.2PLGA-PFOB纳米粒造影剂的制备 采用双步乳化法，将100 mg PLGA-COOH和少量尼罗红染料加入4 ml二氯甲烷中(分散相)置于50 ml离心管，常温振荡至完全溶解，加入60 μl PFOB，振荡数秒，确保与二氯甲烷充分混匀。在冰浴条件下声振仪声振 3 min (130 W，声振5 s、停止5 s)，加入10 ml 4% PVA溶液(连续相)在旋涡器中振荡数秒后以同样功率、频率再次声振3 min。将溶液移至放有磁珠的50 ml烧杯，加入2%异丙醇溶液20 ml，室温下搅拌至少6 h，使二氯甲烷充分挥发，经去离子水多次离心、洗涤，获得荧光标记的PLGA-COOH包裹PFOB的普通纳米造影剂(NPs)，制备过程中全程避光。

1.3PLGA-PFOB纳米粒造影剂的表征

1.3.1表面形态及内部结构 采用光学显微镜、激光共聚焦显微镜以及电子扫描电镜观察PLGA-PFOB纳米粒的大小、分散性；将稀释后纳米粒混悬液置于硅片干燥过夜后，采用电子扫描电镜观察纳米粒的外部形态；将样品滴于铜网上，自然干燥成膜，以透射电镜观察PLGA-PFOB纳米粒内部结构。

1.3.2粒径大小、分布以及表面电位 采用马尔文粒径分析仪测量PLGA-PFOB纳米粒粒径大小、分布以及电位。

1.4 cRGD修饰的靶向纳米粒造影剂的制备 将上述普通纳米粒造影剂分散溶解于适量MES缓冲液(0.1 mol/L，pH值5.5)，以EDC与NHS质量比1∶3、PLGA与EDC摩尔比1∶10先后加入零长度偶联活化剂EDC/NHS，冰浴振荡孵育40 min后，多次洗涤、离心后复溶于MES缓冲液(0.1 mol/L，pH值8)；加入一定量cRGD肽(摩尔比cRGD∶PLGA=1∶1)，冰浴条件(4 ℃)振荡孵育过夜；多次离心、洗涤、收集获得靶向cRGD纳米粒(cRGD-NPs)造影剂，溶于2 ml去离子水中，4 ℃保存。

1.5 cRGD与纳米粒造影剂结合力的检测 将不带有荧光染料的空白NPs混悬液稀释至半透明状态，作为对照组，将制备好的靶向cRGD-NPs混悬液(使用FITC标记的cRGD，绿色荧光)作为实验组，采用流式细胞仪测定FITC荧光强度后与对照组比较。制备靶向纳米粒造影剂前加入尼罗红染料于溶解的PLGA即获得红色荧光标记的NPs，采用激光共聚焦显微镜检测红色荧光染料标记的NPs与绿色荧光染料(FITC)标记的cRGD结合情况。

1.6 cRGD-NPs的毒性测试 用含有10%胎牛血清的DMEM高糖培养基，置于37 ℃、5%CO2细胞培养箱中培养BRL-3A细胞，长满培养瓶后，加入0.25%胰酶，37℃消化，加培养液吹打，传代，取对数生长期的细胞行CCK8试验。将BRL-3A细胞悬液100 μl按接种密度约5.5×103/孔移入96孔培养板中培育24 h，倒掉培养基后每孔加入100 μl不同浓度的cRGD-NPs混悬液(纳米粒浓度用无胎牛血清培养液稀释为20、10、5、2.5、1.25 mg/ml)。24 h后再加入10 μl CCK8试剂孵育4 h后用酶标仪测定450 nm处的吸光度(A)。细胞活力=[A(cRGD-NPs)-A(空白)]/[A(对照)-A(空白)]×100%。

1.7 体外评估cRGD-NPs造影剂靶向特性 体外培养大鼠HSC，取对数生长期细胞，以1×105/孔的密度接种于共聚焦培养皿，培养24 h，分为靶向纳米粒组和非靶向纳米粒组。靶向纳米粒组：每个培养皿加入1 ml经尼罗红染色的靶向cRGD-NPs；非靶向纳米粒组：每个培养皿加入1 ml经尼罗红染色的非靶向NPs；将2组纳米粒与细胞在37 ℃孵箱内孵育1 h后，用4%多聚甲醛1 ml固定15 min，PBS冲洗3次，加入DAPI染色剂对细胞核进行染色。 15 min后以PBS冲洗3次，于激光共聚焦显微镜下观察2组纳米粒与细胞的结合情况。

2 结果

2.1 PLGA-PFOB纳米粒造影剂的表征结果

2.1.1 表面形态及内部结构结果 PLGA-PFOB纳米粒造影剂外观呈乳白色混悬液，稳定性好，不分层，光学显微镜(图1)以及激光共聚焦显微镜(图2)示PLGA-PFOB纳米粒大小均匀，形态规则，分散度好；扫描电镜显示PLGA-PFOB纳米粒外观呈球形，表面规则光滑(图3)；透射电镜显示PLGA-PFOB纳米粒由于PLGA壳与PFOB核不同的电子密度可呈现出壳和核的结构(图4)。

图1 光学显微镜下显示纳米粒大小均匀，形态规整(×600) 图2 激光共聚焦显微镜下显示纳米粒形态规则、分散度好(×600) 图3 扫描电镜显示纳米粒外观呈球形，表面规则光滑(×10 000) 图4 透射电镜显示因液态氟碳PFOB位于纳米粒中心呈现为灰白色，PLGA位于外壳位置呈现灰黑色(×30 000)

图5 激光共聚焦显微镜及流式细胞仪检测纳米粒与cRGD肽的结合情况(×600) A.尼罗红染色的靶向纳米粒呈红色荧光; B.与靶向纳米粒连接的经FITC标记的cRGD肽呈绿色荧光; C.两者在融合通道下呈橙黄色荧光; D.流式细胞仪显示非靶向纳米粒NPs的绿色荧光强度; E.流式细胞仪显示靶向纳米粒cRGD-NPs的绿色荧光强度

图6 纳米粒体外与大鼠肝星状细胞结合情况荧光染色图 A～C.靶向组cRGD-NPs; D～F.非靶向组NPs [A、D：DAPI染色细胞核(蓝色荧光)；B、E.尼罗红染色纳米粒(红色荧光)； C、F：融合图像]

2.1.2粒径大小、分布及表面电位 PLGA-PFOB纳米粒粒径大小为(255.3±66.8)nm，多分散指数为0.025，粒径分布较窄；Zeta电位为(-16.4±5.1)mV。

2.2 cRGD与纳米粒造影剂结合力的检测结果 激光共聚焦显微镜显示尼罗红染色的靶向纳米粒呈红色荧光(图5A)，FITC标记的cRGD呈绿色荧光(图5B)，两者在融合通道下呈橙黄色荧光(图5C)。流式细胞仪检测不带有荧光染料的非靶向纳米粒NPs的绿色荧光(FITC)强度为1.26%(图5D)，靶向纳米粒cRGD-NPs的绿色荧光(FITC)强度为99.66%，即cRGD肽与纳米粒的连接率达99.66%(图5E)。

2.3 cRGD-NPs的毒性测试结果 CCK8试验结果显示大鼠正常肝细胞BRL-3A细胞株加入浓度分别为20、10、5、2.5、1.25 mg/ml的cRGD-NPs混悬液孵育后，细胞活力分别为 (86.6±8.5)%、(89.5±7.8)%、(91.5±7.0%)、(94.9±2.9)%、 (93.8±5.8)%，差异无统计学意义(F=0.754 2，P>0.05)。

2.4 纳米粒造影剂体外靶向性结果 纳米粒经尼罗红染色呈红色荧光，大鼠肝星状细胞细胞核经DAPI染色后呈现蓝色荧光。靶向纳米粒组(cRGD-NPs)显示有大量红色荧光，即被尼罗红染色后纳米粒被大鼠肝星状细胞靶向结合和吞噬，不能穿过核膜位于细胞的细胞质内；非靶向纳米粒组(NPs)仅见少量红色荧光与细胞结合，荧光强度明显低于靶向组(图6)。

3 讨论

黏附分子家族中的整合素参与HSC活化的多个环节，参与细胞和细胞外基质、细胞和细胞间的黏附。RGD序列是多种细胞外基质成分共有的高度保守的氨基酸序列，是整合素与细胞外基质配基或基膜成分配基相结合的识别位点。有研究者[5-7]采用放射性核素、荧光素、顺磁颗粒等示踪剂对RGD配基进行标记，并对整合素αvβ3受体表达追踪。HSC表面可表达多种整合素受体[8]，既往研究[9-10]表明含有精-甘-天冬氨酸的cRGD通过受体介导的细胞内吞作用可被活化状态的星状细胞选择性的摄取，因此笔者采用氨基酸序列Cys-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Cys定制获得cRGD，通过碳二亚胺法将cRGD侧链的氨基与PLGA-COOH的羧基形成稳定的肽键，从而将cRGD连接到NPs表面获得cRGD-NPs，该连接方法较为稳定，在体内外受环境影响较小[11]。本实验运用激光共聚焦以及流式细胞仪证实了靶向造影剂通过碳二亚胺法成功与cRGD连接，且连接率较高, 达99.66%。

超声分子成像技术是近年来超声医学研究的热点，而分子探针是超声分子影像学发展的基础，微泡超声造影剂作为超声分子探针重要载体已在国内外研究[12-13]获得成功。但微泡造影剂的直径较大，难以穿过血管内皮间隙到达靶组织，只能实现血管内显像。因此需制备一种高靶向性、粒径较小的纳米级超声造影剂。液态氟碳是全氟碳化物的一种，具有高度稳定性和良好的携氧功能，循环半衰期长，有研究[14-15]成功制备了包裹液态氟碳的纳米级高分子超声造影剂不仅可用于超声显像，还可实现CT、MRI的显像。本实验选用的液态氟碳PFOB是一种具有稳定性好、生物安全性高的液态氟碳[16]。本研究制备的PLGA-PFOB纳米粒造影剂稳定性高，在4 ℃条件存放1周以内均可保持很好的混悬状态和分散性，粒径变化不明显；细胞毒性CCK8的实验结果表明纳米粒造影剂即使在较高浓度对大鼠正常肝细胞几乎无毒性，细胞活力差异无统计学意义(F=0.754 2，P>0.05)，生物安全性高。

在体外寻靶实验中，通过激光共聚焦显微镜观察，发现靶向组有大量的靶向cRGD-NPs被HSC识别并摄取，即使经PBS反复冲洗，仍可紧密结合，红色荧光强度明显高于非靶向组，表明cRGD-NPs对HSC有很高的特异性结合能力。但因在制备纳米粒造影剂过程中仍有少许染料不能被完全漂洗干净，会被细胞少量吞噬，因而非靶向纳米粒组也会呈现少许红色荧光。

本实验未对造影剂的体内外显像进行分析，但本课题组前期[15,17]已经成功制备了具有超声/CT双模态显像的PFOB微球，可使肝脏持续强化，增强肝脏肿瘤的显像，且Pisani等[14]也通过体内外实验证实PLGA-PFOB纳米粒造影剂的超声/MRI双模态显像能力。随后笔者将进一步验证cRGD-NPs的体内外显像能力，尝试为体内肝纤维化的分子显像提供新的方法。

综上所述，本实验将高分子材料PLGA-COOH与液态氟碳PFOB通过双步乳化法制成纳米造影剂，再通过碳二亚胺化学连接法，将环八肽cRGD连至造影剂表面，获得cRGD-NPs；该造影剂形态规则，呈球形，大小较均一；在体外寻靶实验中，该靶向纳米粒造影剂与HSC结合率高。

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Experimental study on preparation and targeting research in vitro of targeted nanoparticle ultrasound contrast agent carrying cRGD

XUANJiqing1,CHENYuli1,AOMeng1,2*,WANGZhigang1,2,ZHENGYuanyi1,2,3,WANGZhaoxia4,LIAo5

(1.ChongqingKeyLaboratoryofUltrasoundMolecularImaging,theSecondAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity，Chongqing400010,China; 2.DepartmentofUltrasound,theSecondAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400010,China; 3.DepartmentofUltrasound,ShanghaiJiaoTongUniversityAffiliatedShanghaiSixthPeople'sHospital,Shanghai200233,China; 4.DepartmentofUltrasound,theChildren'sHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China;5.DepartmentofUltrasound,theFirstAffiliatedHospitalofNanjingMedicalUniversity,Nanjing210029,China)

Objective To prepare a poly (lactic-co-glycolic acid) (PLGA) nanoparticles ultrasound contrast agent carrying cRGD, and to investigate its targeting ability to the rat hepatic stellate cells (HSC) in vitro. Methods PLGA-PFOB nanoparticles were prepared by a double emulsion solvent evaporation process with a modified polymeric shell (PLGA-COOH) encapsulating perflurooctyl bromide (PFOB). The morphological and structural characteristics of the nanoparticles were observed by an optical microscope, scanning electron microscopy and transmission electron microscopy. The size, distribution and Zeta potential were observed using Malvern particle size analyzer. The cRGD was conjugated onto the nanoparticles by carbodiimide technique. The combination of cRGD with nanoparticles (cRGD-NPs) and the targeting function of cRGD-NPs in vitro were proved by laser scanning confocal microscopy (LSCM). Results The samples were milk white in deionized water, with a mean diameter of (255.3±66.8)nm and a polydispersity index of 0.025. Zeta potential was (-16.4±5.1)mV. Scanning electron microscopy images reveal that majority of capsules were spherical with smooth surface. Transmission electron microscope resented spherical particle with a core-shell structure. By observing LSCM, Nile red-dyed NPs emitted red fluorescence, FITC-labeled cRGD emitted green fluorescence, and overlay fluorescence image emitted bright homogeneous yellow fluorescence. It was found that greater and stronger red fluorescence representing cRGD-NPs could be observed in the cytoplasm of HSC while fewer NPs remained within HSCs in the non-targeted group. Conlusion The PLGA encapsulated PFOB nanoparticles carrying cRGD (cRGD-NPs) can be prepared successfully. The cRGD-NPs contrast agent has strongly specific affinity on the HSC.

Target; Nanoparticles; Ultrasonography; Contrast media

国家自然科学基金青年基金(81501482、81401427)、国家自然科学基金(81227801)、国家杰出青年科学基金(81425014)。

宣吉晴(1982—)，女，四川泸州人，在读博士，主治医师。研究方向：超声造影剂的基础与临床。E-mail: alice11@yeah.net

敖梦，重庆医科大学附属第二医院超声分子影像学重庆市重点医学实验室，400010；重庆医科大学附属第二医院超声科，400010。

E-mail: aomeng735@163.com

2017-02-15

2017-04-27

R445.1

A

1003-3289(2017)06-0810-06

10.13929/j.1003-3289.201702043