12/15-脂氧合酶抑制剂黄芩素对软骨细胞凋亡的抑制作用研究*

陈恺哲燕宇飞袁俊郭蕾何川*

12/15-脂氧合酶抑制剂黄芩素对软骨细胞凋亡的抑制作用研究*

陈恺哲1，2燕宇飞1，2袁俊1，2郭蕾2何川1，2*

目的 探讨12/15-脂氧合酶抑制剂黄芩素（Baicalein）对硝普钠（SNP）诱导的软骨细胞凋亡的抑制作用及可能机制。方法取8周雄性SD大鼠膝关节软骨，采用Ⅱ型胶原酶消化法提取软骨细胞并体外培养。设置对照组、SNP凋亡组和Baicalein给药组，以0.5 mM SNP作用24小时诱导软骨细胞凋亡，以5 M,25 M,50 M, 100 M不同浓度的Baicalein作用细胞，确定最适浓度，对照组仅加入同体积溶剂（蒸馏水）。CCK8法检测药物对细胞毒性；Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡；免疫荧光观测凋亡诱导因子（AIF）在软骨细胞中的定位。结果Baicalein在各浓度下对软骨细胞无明显毒性，与对照组相比，凋亡组软骨细胞活性明显下降（P<0.01），与凋亡组相比，给药组细胞活性浓度依赖性地升高（P<0.01）；流式检测显示对照组软骨细胞早期凋亡率3.16%，凋亡组27.8%，100 M Baicalein给药组14.1%；免疫荧光检测显示，凋亡组AIF出现核内移位，100 M Baicalein给药组AIF核移位受到抑制。结论Baicalein通过抑制12/15-脂氧合酶活性，进而抑制AIF从线粒体中的释放及核转位，发挥抗软骨细胞凋亡作用。

花生四烯酸盐12-脂氧合酶；花生四烯酸盐15-脂氧合酶；脂氧合酶抑制剂；软骨细胞；细胞凋亡

骨关节炎（Osteoarthritis,OA）是以软骨变性、软骨下骨硬化及骨赘生成为主要特征的慢性退行性疾病，在全世界范围内，影响着60岁以上约18%女性和10%男性[1]。细胞炎症性凋亡是OA发病机制的重要方面，由退变积累的代谢产物引起关节内炎症反应，使软骨细胞凋亡加剧，加速了关节炎发生发展。多不饱和脂肪酸是产生炎症介质的主要来源之一，脂氧合酶(lipoxygenases,LOXs)是其代谢的关键酶类，可将花生四烯酸(arachidonic acid,AA)等多不饱和脂肪酸转变为生物活性产物，进而影响细胞正常功能代谢。12/15-脂氧合酶(12/15-LOX)为其成员之一，组织中分布广泛，参与了多种慢性炎症性疾病的病理过程如动脉粥样硬化、糖尿病、帕金森病等[2]。然而12/15-LOX在骨关节炎中的作用尚缺乏认识，其对软骨细胞凋亡的影响，国内亦罕有研究。故本文拟利用12/15-LOX抑制剂黄芩素（Baicalein），探讨其对硝普钠（SNP）诱导的大鼠软骨细胞凋亡的影响及可能机制，为进一步诊治骨关节炎寻找新的治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

DMEM/F-12培养基，Ⅱ型胶原酶，0.25%胰蛋白酶，胎牛血清（FBS）（美国Gibco）；硝普钠（美国Sigma）；CCK8检测盒(日本Dojindo)；Alexa Fluor488，DAPI（美国Thermo Fisher）；AIF兔多克隆抗体（美国Abcam）；Annexin VFITC/ PI凋亡检测盒，FACSort流式细胞仪（美国BD）；LX-800酶标仪（美国BioTek），荧光显微镜（德国Carl Zeiss）。

1.2 软骨细胞培养

取8周龄SPF级雄性SD大鼠双侧膝关节，无菌条件下剥取关节软骨，切碎至1mm3，加入20倍于软骨组织的0.25%胰酶约10 mL，37℃消化30分钟，1500 rpm离心5分钟后，弃上清，加入0.2%Ⅱ型胶原酶约10 mL，37℃消化4小时。离心弃上清后，以含10%FBS的DMEM/F-12培养基重悬软骨细胞，按原代细胞培养密度（2×106）接种于10 cm培养皿中，37℃，5%CO2培养箱中培养，隔天换液。为维持软骨细胞特定表型，只使用第2代细胞。

1.3 实验分组

将软骨细胞分为对照组、SNP凋亡组、Baicalein给药组。SNP凋亡组以0.5 mMSNP作用24小时，诱导大鼠软骨细胞凋亡。给药组在加入SNP同时，以5 M，25 M，50 M，100 M Baicalein不同浓度梯度作用细胞，确定最适浓度用于后续实验。对照组细胞仅加入同体积药物溶剂。

1.4 CCK8检测

待初代软骨细胞达80%融合时，胰酶消化后传代至96孔板，控制每孔100 L约5000个细胞，每组设6复孔。检测前，每孔添加100 L CCK8试剂，继续孵育2小时，然后用酶标仪测定450 nm光密度（OD）值，收集数据并绘制曲线。另设空白对照，只加入培养基以消除背景。

1.5 流式细胞术

软骨细胞以药物分组处理24小时后，用0.25%不含EDTA胰酶消化5分钟并转移至流式管，离心弃上清。每管加100 L结合缓冲液重悬细胞，再各加5 L Annexin V及5 L PI染液，室温避光孵育15分钟，最后加入100 L结合缓冲液，充分混匀后，上机检测。其中调零组取正常软骨细胞，只加入结合缓冲液。

1.6 免疫荧光检测软骨细胞凋亡因子（AIF）表达

以0.5×106接种密度将软骨细胞接种于预置了细胞爬片的六孔板中，待贴壁后分别给予药物刺激24小时，弃培养液，加入4%多聚甲醛室温固定15分钟；PBS漂洗3次后，TritonX-100破膜15分钟，PBS漂洗。待免疫荧光封闭液室温封闭1小时后，加入AIF抗体（1：1000）约100 L覆盖细胞爬片，4℃孵育过夜。次日加入荧光二抗（1：1000），室温避光孵育1小时，DAPI染核，于荧光显微镜下观测。

1.7 统计方法

SPSS 19.0软件分析数据，计量资料采用平均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 Baicalein对软骨细胞无明显毒性

为了探讨12/15-LOX抑制剂Baicalein对大鼠软骨细胞是否有毒性，依次配置5/25/50/100 M等浓度作用细胞，24小时后检测细胞CCK8活性，绘制OD450 mm变化曲线（图1A）。统计分析显示各组无统计学差异，Baicalein对软骨细胞无明显致毒性。进一步，将细胞设为6组，造模组以0.5 mMSNP诱导凋亡，给药组同时加入浓度梯度的Baicalein，24小时后同时测定CCK8活性，结果显示与对照组相比，凋亡组软骨细胞活性明显下降（P<0.01），与凋亡组相比，给药组细胞活性浓度依赖性地升高（P<0.01）（图1B）。综上，以100 M Baicalein为最适浓度用于后续实验。

2.2 Baicalein抑制软骨细胞凋亡

采用Annexin V/PI双染结合荧光标记的方法，通过流式细胞术检测软骨细胞药物处理24小时后的早期凋亡率，呈Annexin V(﹢)/PI(﹣)。结果显示（图2，彩图见插页），对照组软骨细胞早期凋亡为3.16%；凋亡组27.8%；100 MBaicalein给药组14.1%，另外其晚期凋亡及死亡细胞数也有一定程度减少。

2.3 Baicalein抑制软骨细胞凋亡因子核转位

凋亡因子（AIF）在荧光显微镜下呈绿色荧光，细胞核呈蓝色荧光，对照组AIF分布于软骨细胞胞质中（图3 A-C）；凋亡组中，经诱导发生凋亡的软骨细胞内AIF向核内移位（图3 DF）；在100 MBaicalein干预后，AIF核移位受到抑制（图3 G-I，彩图见插页）。

3 讨论

细胞凋亡作为一种受严格控制，程序性的死亡方式，对维持细胞稳态至关重要，当代谢紊乱持续存在，将导致细胞凋亡过度，对软骨细胞来说，意味着细胞坏死，细胞外基质的崩解以及关节生物特性的丧失。炎症介导的软骨细胞凋亡是OA主要病理改变[3]，NO（一氧化氮）作为其中重要的炎症因子，常用SNP作为外源性供体，广泛应用于细胞凋亡研究[4]；在细胞内由诱导型NO合成酶（iNOS）生成，持续的外力刺激、关节创伤、内分泌代谢障碍等因素将引起包括NO在内的多种促炎因子表达升高，造成软骨细胞失稳态，诱导细胞凋亡；而凋亡过程中产生及释放的凋亡蛋白，如Caspase、AIF等进一步引起基质金属蛋白酶（MMPs）分泌到间质中，造成了关节内病变的恶性循环，加速OA进程[5]。因而抑制软骨细胞凋亡的相关研究一直是OA治疗的热点。

图1 各组软骨细胞CCK8活性（***<0.01）

图2 流式细胞术检测各组软骨细胞凋亡情况

图3 各组软骨细胞AIF免疫荧光定位（400×，标尺为50 m）

脂氧合酶是以非血红素铁蛋白为辅基的双加氧酶，人15-LOX-1与哺乳动物12-LOX高度同源，功能类似，统称为12/15-LOX[6]。多不饱和脂肪酸除了能经环氧合酶（COX）[7]途径外，还能经LOX代谢产生炎症介质，经12/15-LOX途径产生羟十八碳二烯醇（HODE）、羟基廿碳四烯酸(HETE)、脂氧素A4(LXA4)等，在不同器官组织及疾病中广泛分布，介导炎症作用。Nadir等[8]检测了人OA软骨中15-LOX表达，验证了其代谢产物13-HODE/15-HETE能抑制白介素-1（IL-1）诱导的MMP-1/13上调。亦有研究提出12/15-LOX对炎症性关节炎有促进作用，Wu等[9]利用敲除15-LOX的小鼠类风湿性关节炎模型，发现敲除15-LOX的小鼠关节病理表现减轻，其主要类风湿因子—胎盘生长因子（PGF）明显减少。也有学者提出，12/15-LOX具有两面性，能通过不同代谢途径发挥截然相反的作用[10]。

Baicalein，中文学名黄芩素，是黄芩根中提取的主要有效成分，作为含黄酮类化合物，能特异性地抑制12/15-LOX活性[11]。很多疾病包括脑缺血、多发性硬化症、心肌缺血再灌注[12]等的研究中都显示了Baicalein具有抗炎、抗氧化以及抗细胞凋亡的作用。近年来，Baicalein在骨关节炎中的作用逐渐引起学者关注，Chen等[13]研究了Baicalein对聚蛋白多糖酶-4/-5（ADAMTS-4/-5）与组织蛋白酶-K/-B（cathepsin-K/-B）具有抑制作用，Zhang等[14]利用IL-1和肿瘤坏死因子-（TNF-）诱导人软骨细胞炎症性凋亡，验证了Baicalein通过抑制Caspase通路进而改善细胞凋亡和基质降解。本研究首先利用CCK8细胞活性检测，证明了Baicalein在体外对大鼠软骨细胞无明显毒性；在SNP诱导的软骨细胞凋亡模型中，Baicalein能浓度依赖性地抑制NO对细胞的损伤作用，并通过流式检测，进一步证实了Baicalein抑制软骨细胞凋亡，得到与上述研究类似的结论。另外，本文探讨的另一细胞因子—AIF，是一种广泛表达的黄素蛋白，有研究显示其在细胞不同部分有着不同效应[15]，正常情况下，AIF分布于线粒体膜间隙，具有氧化还原酶活性，发挥着清除活性氧、维持细胞呼吸链稳定的作用；当细胞损伤，凋亡信号刺激线粒体使其通透性改变，AIF会从中释放出来，入核后与DNA结合，通过不依赖caspase的途径发挥细胞凋亡作用。本文在对AIF进行免疫荧光检测中发现，Baicalein能明显抑制AIF的核移位，阻止因其入核而使凋亡进一步加剧，阐明了Baicalein抑制软骨细胞凋亡的一种可能机制。当然，作为12/15-脂氧合酶抑制剂的Baicalein，其在细胞内可能通过更广泛而尚未知的代谢通路发挥效应，仍需要我们进一步探索。

综上，Baicalein通过抑制12/15-脂氧合酶活性，进而抑制AIF从线粒体中的释放及核转位，发挥抗软骨细胞凋亡的作用。未来，我们将开展更深入的细胞生物学及动物研究，探讨12/15-LOX对软骨细胞功能的影响，阐明12/15-LOX通路对骨关节炎的病理抑制作用，为临床治疗提供新的思路和策略。

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Inhibition of 12/15 lipoxygenase by baicalein alleviates chondrocyte apoptosis

Chen kaizhe1,2,Yan yufei1,2,Yuan jun1,2,et al.1DepartmentofOrthopaedics,Ruijin Hospital,Shanghai JiaoTong University School of Medicine;2 Shanghai Institute of Orthopaedics and Traumatology,Shanghai 200025,China

Objective To investigate the inhibitory effect and possible pathogenesis of Baicalein,12/15-lipoxygenase inhibitor,on apoptosis of chondrocytes induced by sodium nitroprusside(SNP).Methods Control group,SNP group and Baicalein group were setting.The 0.5 mM SNP was used to induce apoptosis for 24 hours,meanwhile,Baicalein group was treated additionally with a variety of concentration gradient of 5 M,25 M,50 M,100 M to determine the optimum concentration.The control group

only the same volume of solvent.The cytotoxicity of reagents was detected by CCK8.The Annexin V/PI double staining was used to determine the apoptosis rate.The immunofluorescence was used to detect the intracellular localization of apoptosis inducing factor(AIF)in chondrocytes.Results Baicalein has no statistically significant in toxicity to chondrocytes at multiple concentration gradients,the activity of chondrocytes in the SNP group decreased significantly compared with the control group(P<0.01),and Baicalein increased the cytoactive in a concentration-dependent manner compared with the SNP group(P<0.01),flow cytometry analysis showed that the early apoptosis rate of chondrocytes was 3.16%in control group,27.8%in SNP group and 14.1%in 100 MBaicalein group,respectively.Immunofluorescence assay showed that the nuclear translocation ofAIF was observed in SNP group compared with the control group,while the nuclear translocation of AIF was inhibited in Baicalein-treated group.Conclusion The 12/15-lipoxygenase inhibitor,Baicalein,has anti-apoptosis effect on chondrocytes through inhibiting the release of AIF from mitochondria and nuclear translocation.

Arachidonate 12-Lipoxygenase;Arachidonate 15-Lipoxygenase;Chondrocytes;Apoptosis

Q255

A

10.3969/j.issn.1672-5972.2017.03.002

swgk2017-02-00019

2017-2-15）

上海市卫生和计划生育委员会科研基金项目（201540275）；上海市中西医结合临床重大项目（ZY3-LCPT-2-2003）

1上海交通大学医学院附属瑞金医院骨科；2上海市伤骨科研究所，上海200025

陈恺哲（1991-），男，硕士研究生。研究方向：骨与关节病损。

*[通讯作者]何川（1971-），男，博士，副主任医师。研究方向：关节外科。