表没食子儿茶素没食子酸酯对稳定表达淀粉样前体蛋白的SH-SY5Y细胞抗炎抗凋亡作用研究

王 晶

辽宁中医药大学附属医院(沈阳 110032)

·论著·

表没食子儿茶素没食子酸酯对稳定表达淀粉样前体蛋白的SH-SY5Y细胞抗炎抗凋亡作用研究

王 晶

辽宁中医药大学附属医院(沈阳 110032)

目的 探讨表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechingallate，EGCG)对稳定表达淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein, APP)的SH-SY5Y细胞抗炎抗凋亡的保护作用。方法 将SH-SY5Y细胞分为对照组、模型组(稳定表达APP的细胞)和EGCG组(APP+10、20、30 μmol/L的EGCG)。免疫荧光细胞化学法观察APP在各组细胞中表达；MTT法检测细胞存活能力；TUNEL法检测细胞凋亡情况；RT-PCR法检测Bax、Bcl-2和Caspase-3表达；ELISA法测定IL-6和TNF-α浓度。结果 模型组中，APP高表达；与模型组比较，给予20 μmol/L EGCG的EGCG组明显提高SH-SY5Y细胞的存活率，减少细胞凋亡数目，下调Bax/Bcl-2比例及Caspase-3 mRNA表达，减少IL-6和TNF-α浓度。结论 EGCG对稳定表达APP的SH-SY5Y细胞有一定保护作用，可能是通过抗炎以及减少细胞凋亡发挥治疗作用。

EGCG；APP；阿尔茨海默病；SH-SY5Y细胞；细胞凋亡

阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease, AD)，又名老年痴呆，是一种中枢神经退变性疾病，起病隐匿，病程缓慢且具有持续性，以渐进性记忆缺失、认知功能降低及语言表达不清等为主要临床表现[1]。目前，较为公认的AD发病机制是突变的淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)基因先后被β-分泌酶(BACE1)和γ-分泌酶剪切形成Aβ1-42，其在脑内异常沉积，并触发一系列炎症等不良反应，导致脑内神经细胞大量损伤乃至凋亡[2-3]。现如今，我国老龄化人口成指数增长，AD也成为了社会上较为严重的问题，所以，最为紧迫的是采用有效药物来延缓或者治疗AD，提高患者及其家属的生活质量。

绿茶是我国主要茶类之一，有着将近5 000年的历史，其中，含有茶多酚、儿茶素及维生素等营养成分[4]。表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechingallate,EGCG)是绿茶中的有效活性成分，具有抗肿瘤、抗氧化以及抗炎等药理作用[5-6]。最近，研究[7-9]表明，EGCG可通过抑制Aβ聚集、抑制Tau蛋白磷酸化以及增强乙酰胆碱水平等，对AD发挥神经保护作用，但对AD的抗炎抗凋亡作用还未见报道。因此，本实验用含有突变APP695基因的SH-SY5Y细胞作为细胞模型来模拟AD，旨在探讨EGCG的抗炎抗凋亡作用，为临床治疗AD提供一种新的治疗方法。

1 材料与方法

1.1 试剂

EGCG(购自Sigma公司)溶于二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO，Sigma)，终浓度<0.1%，用DMEM /F12( dulbecco′s modified eagle medium/F12，Gibco)配成含有10、20、30 μmol/L的EGCG培养液待用。胎牛血清 (fetal calf serum, FBS)购自Gibco公司； 青-链霉素购自Thermo公司；MTT购自Sigma公司；一抗兔抗APP购于北京博奥森生物有限公司；二抗为驴抗兔FITC购自Jackson公司；DAPI染色液购自Sigma公司；一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司；RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒购自Thermo公司；PCR Master Mix Kit试剂购自Thermo公司；IL-6、TNF-α人的ELISA试剂盒购自杭州朗基科学仪器有限公司。

1.2 仪器

倒置荧光显微镜 (DYF-880，上海点应光学)，CO2培养箱 (DHP-9052，上海印溪)， PCR仪 (Bio-rad，北京伯迈)，凝胶成像系统 (2500R，上海天能)，紫外可见分光光度计(UV-9000，上海元析)，酶标仪(BS-1101，南京德铁)。

1.3 SH-SY5Y细胞培养

稳定表达APP695基因突变的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞(购于美国Burnham医学院)，正常SH-SY5Y细胞(购自中国科学院动物研究所)，以6×109/L密度接种于经多聚赖氨酸包被过的培养皿中，加入含有10% FBS和1%青-链霉素的DMEM/F12培养基，放置于37 °C，CO2培养箱中培养。每天全量换液1次，隔天传代，并在显微镜下进行观察[10]。

1.4 免疫荧光细胞化学法检测正常以及稳定表达APP的SH-SY5Y细胞中APP的表达

将正常的SH-SY5Y细胞以及稳定表达APP的SH-SY5Y细胞以6×105/mL的密度接种于多聚赖氨酸包被的96孔板中，100 μL/孔，共10孔。待细胞融合度达到80%～90%时，吸净培养基， 4%多聚甲醛固定30 min；1%PBS洗涤3次，5 min/次后，再加入1%Tritox X-100透化15 min；1%PBS洗3次，5 min/次后，将兔抗APP以1∶150比例稀释后，加入到各个孔中，4 ℃过夜； 1%PBS洗3次，5 min/次后，将驴抗兔的二抗以1∶200稀释后，加入到各个孔中，室温孵育1 h后，1%PBS洗3次，5 min/次，洗去二抗；以1∶50比例加入 DAPI染色液，室温避光放置15 min后，于倒置荧光显微镜下拍照，保存[11]。

1.5 细胞分组

将SH-SY5Y细胞分为对照组、模型组(稳定表达APP的细胞)以及EGCG组(对稳定表达APP的SH-SY5Y细胞，给予10、20、30 μmol/L的EGCG)，置于37 °C，5% CO2空气培养箱中培养，并进行以下实验。

1.6 MTT法检测各组SH-SY5Y细胞活力

将置于96孔板中经处理的各组SH-SY5Y细胞，每孔加入浓度为0.5 mg/mL的MTT溶液20 μL，在培养箱中孵育4 h后，弃掉上清液，加入150 μL DMSO溶液，在摇床上慢慢摇动15 min，直至紫色甲瓒完全溶解，并用酶标仪在492 nm处测定吸光度[12]。每组3个复孔，重复3次实验。

1.7 TUNEL法检测细胞凋亡

取置于96孔板中经处理的各组SH-SY5Y细胞，吸去培养基，加入4%多聚甲醛固定25 min；1%PBS洗3次，5 min/次后，再向各孔中加入1%Tritox X-100透化5 min；1%PBS洗3次后，每孔加入50 μL TdT溶液；暗处孵育60 min后，每孔加入streptavidin-TRITC溶液，37 ℃，孵育30 min； 1%PBS洗3次后，加入 DAPI染色液(1∶50)，室温避光放置10 min后，于倒置荧光显微镜下观察，拍照[10]。每组3个复孔，重复3次实验。

1.8 RT-PCR检测各组SH-SY5Y细胞中Bcl-2、Bax和Caspase-3的表达

取按1.5分组并处理的细胞，弃去培养基，按查找文献[13]所示方法，利用Trizol提取各组细胞的RNA，按RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒说明书所示步骤，将RNA反转成cDNA；PCR Master Mix Kit 试剂盒说明书所示步骤，构建PCR反应。相关引物序列如下(表1)。反应条件：预变性95 ℃，2 min；变性95 ℃ ，30 s，退火60 ℃ ，30 s，延伸72 ℃，1 min，扩增35个循环；终延伸72 ℃ ，10 min。以β-actin作为内参，扩增物用琼脂糖凝胶电泳及凝胶成像系统记录拍照，用Image J图像分析软件对条带进行光密度扫描，结果用相对光密度表示，相对光密度=光密度目的基因/光密度β-actin。重复3次实验。

表 1 相关基因序列

1.9 ELISA法检测各组SH-SY5Y细胞上清中IL-6和TNF-α的表达

利用ELISA试剂盒检测各组细胞上清液中IL-6和TNF-α两种炎症因子的表达，按照说明书所示进行操作。吸取置于96孔板中经处理的各组SH-SY5Y细胞的上清液50 μL，加入酶标板中，每组3个复孔，加入50 μL酶标溶液；37 ℃，温育60 min后，每孔加入显色剂A和B各50 μL；37 ℃避光显色15 min后，加入50 μL终止液，并利用酶标仪在450 nm处测量其吸光度。根据绘制的标准曲线计算各组细胞上清液中炎症因子浓度。

1.10 统计学方法

2 结果

2.1 APP在正常以及稳定转染APP的SH-SY5Y细胞中的表达

在对照组中，APP的表达很少，而APP组中呈现高水平表达(绿色)。此外，根据DAPI染色的细胞核中也可看出，对照组的细胞核呈圆形，较饱满，形态较好，而模型组的细胞核多数呈梭形，破裂较多(图1)。

图1 免疫荧光细胞化学法检测2组细胞中APP的表达

2.2 EGCG增强稳定表达APP的SH-SY5Y细胞的活力

模型组的SH-SY5Y细胞活力(67.0±6.30)% 与对照组 (100%)比较，有明显下降，差异有统计学意义(P<0.01)，而给予不同浓度EGCG的EGCG组存活率分别为(77.01±5.81)%、(90.00±8.92)%和(91.00±10.11)%，与模型组相比，具有明显提高(P<0.05，P<0.01)。其中，浓度为 20、30 μmol/L EGCG的SH-SY5Y细胞存活率差异无统计学意义(P>0.05)，因此，以下实验均用 20 μmol/L的 EGCG(图2)。

2.3 EGCG减少稳定表达APP的SH-SY5Y细胞的凋亡率

模型组的TUNEL阳性细胞率(34.50±4.11)%(红色)，较对照组(4.30±0.59)%增加(P<0.01)；而给予了EGCG稳定表达APP的SH-SY5Y细胞的TUNEL阳性细胞率为(20.11±1.50)%，与模型组相比，差异有统计学意义(P<0.01)(图3)。

图2 MTT法比较各组SH-SY5Y细胞活力

注：与对照组比较，**P<0.01；与模型组比较；#P<0.05,##P<0.01

注：A.TUNEL染色凋亡细胞(红色)，DAPI染色细胞核(蓝色)；B.定量分析细胞凋亡率；与对照组比较，**P<0.01；与模型组比较，##P<0.01

2.4 EGCG对稳定表达APP的SH-SY5Y细胞中Bax、Bcl-2和Caspase-3表达的影响

用RT-PCR法检测了EGCG对稳定表达APP的SH-SY5Y细胞凋亡的影响，结果显示，模型组与对照组相比，凋亡因子Bax/Bcl-2 mRNA比例(4.60±0.55 vs. 1.00±0.09)和Caspase-3 mRNA的表达量(2.01±0.12 vs. 0.98±0.04)明显升高(P<0.01)；而EGCG组与模型组相比，凋亡因子Bax/Bcl-2 mRNA比例(2.42±0.26 vs. 4.60±0.55)和Caspase-3 mRNA的表达量(1.52±0.08 vs. 2.01±0.12)明显降低(P<0.01)(图4)。

图4 各组SH-SY5Y细胞中Bax、Bcl-2和Caspase-3表达的比较

注： A. RT-PCR 法检测各组细胞中Bax、Bcl-2和Caspase-3 mRNA的表达，β-actin为内参；B、C. Image J分析并比较Bax/Bcl-2和Caspase-3 mRNA的表达；与对照组比较，**P<0.01；与模型组比较，##P<0.01

2.5 EGCG对稳定表达APP的SH-SY5Y细胞中IL-6和TNF-α表达的影响

为了验证EGCG是否对稳定表达APP的SH-SY5Y细胞具有抗炎作用，使用ELISA试剂盒来检测各组细胞上清液中IL-6和TNF-α的浓度，结果显示，对照组细胞上清液中IL-6和TNF-α浓度分别为(15.91±1.41) pg/mL、(31.62±4.56) pg/mL，模型组细胞上清液中IL-6和TNF-α浓度分别为(70.10±8.03) ng/mL、(120.13±15.10) ng/mL，与对照组相比，差异有统计学意义(P<0.01)；在给予了EGCG后的细胞上清液中，IL-6和TNF-α浓度明显降低到(37.30±2.69 )ng/mL、(80.61±8.06 )ng/mL，与模型组相比，差异有统计学意义(P<0.01)(图5)。

图5 ELISA法检测各组细胞中IL-6和TNF-α的浓度

3 讨论

EGCG是绿茶中的有效成分，属于儿茶素，具有抗血栓形成、抗炎以及抗氧化等药理作用[5-6,14]。EGCG在AD的防治方面也有一定进展，例如闫玉芳等[7]在APP转基因的小鼠细胞体外模型中发现，EGCG可在基因及蛋白水平上抑制BACE1的表达，使Aβ生成减少来发挥治疗作用；而Rezai-Zadeh等[8]在APP转基因大鼠的体内实验发现，给予转基因大鼠灌胃50 mg/kg的EGCG后，Tau蛋白的病理现象得到了明显改善。因此，本实验通过选用稳定表达APP的SH-SY5Y细胞模拟AD细胞模型，并用免疫荧光细胞化学法来检测细胞模型的稳定与可靠。结果发现，20 μmol/L的EGCG可明显促进模型组细胞的存活能力，减少细胞凋亡的数目。

细胞凋亡一般是指细胞在外来或自身因素的作用下，通过调控细胞内基因及其产物而发生的一种程序性细胞死亡。Bcl-2蛋白家族是调节线粒体通透性的主要成分，通过与Bax形成二聚体，对细胞凋亡进行调控，当Bax过表达是促进细胞凋亡，当Bal-2过表达为抑制细胞凋亡并且促进神经细胞神经功能的修复[15-16]。而Bax与Bcl-2比例的增大，会导致Caspase-3表达增多，进而导致细胞凋亡[17]。本实验发现，稳定转染APP的SH-SY5Y细胞的凋亡数较正常组明显增多，提高了Bax/Bcl-2的比例以及Caspase-3 mRNA的表达；而给予了EGCG的给药组能够明显减少模型组细胞的凋亡数，降低Bax/Bcl-2的比例以及Caspase-3 mRNA的表达，因此，EGCG具有抑制稳定转染APP的SH-SY5Y细胞凋亡的作用。

近年来，研究[18]发现，脑内大量沉积的Aβ会与神经胶质细胞的受体结合，激活脑组织中的小胶质细胞，进而释放大量炎症因子，如IL-6和TNF-α等，诱发脑内炎症反应或直接损伤神经元，最终导致大量神经元损伤、溃变乃至死亡。本实验利用ELISA法检测了细胞上清中IL-6和TNF-α的表达，结果发现， 模型组的细胞上清中，IL-6和TNF-α的浓度较正常组明显增多，当给予EGCG后，细胞上清中的IL-6和TNF-α的浓度均有明显降低，说明了EGCG对炎症反应也有抑制作用。

综上所述，EGCG对稳定转染APP的SH-SY5Y细胞有一定的神经保护作用，其作用可能是通过抑制细胞凋亡、减轻炎症因子表达来实现，为有效治疗AD等神经退行性疾病提供了新思路。

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A Study on the Anti-inflammatory and Anti-apoptosis Effect of EGCG on APP-expressing SH-SY5Y Cells

Wang Jing.

The Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Shenyang 110032, China

Objective To investigate the anti-inflammatory and anti-apoptosis effect of EGCG on human SH-SY5Y cells expressing amyloid precursor protein (APP) stably. Methods The SH-SY5Y cells were randomly divided into three groups including the control group, model group (SH-SY5Y cells expressing APP stably ), and EGCG group ( APP-expressing cells treated with 10, 20 and 30 μmol/L EGCG respectively). The expression of APP was confirmed by the immunofluoresence staining; the cell viability was assessed by MTT; the number of cell apoptosis was assessed by TUNEL; the mRNA expression of Bax, Bcl-2 and Caspase-3 were determined by RT-PCR; the concentration of IL-6 and TNF-α was assessed by ELISA. Results The APP expression was higher in the model group. Compared with the model group, The administration of 20 μmol/L EGCG promoted the survival rate of SH-SY5Y cells, reduced the number of apoptotic cells, downregulated the radio of Bax and Bcl-2 and the mRNA expression of Caspase-3, and decreased the concentration of IL-6 and TNF-α. Conclusion EGCG has protective effect on the APP-expressing SH-SY5Y cells and the therapeutic effect may be achieved by anti-inflammation and anti-apoptosis.

EGCG; APP; Alzheimer′s disease; SH-SY5Y cells; Cell apoptosis

http://kns.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20170321.0920.010.html

10.3969/j.issn.1674-2257.2017.03.004

R284

A