Avastin对碱烧伤角膜内新生淋巴管和血管形成的影响

王 进,孙 亮,齐秀英,马 晶

(1.黑龙江哈尔滨普瑞眼科医院，黑龙江 哈尔滨 150000；2.哈尔滨医科大学解剖学教研室，黑龙江 哈尔滨 150081)

正常角膜组织内没有血管及淋巴管分布以维持角膜的透明状态和保持角膜处于“免疫赦免”状态。在角膜化学烧伤、感染及移植手术的情况下，角膜在损伤修复过程中可能有新生淋巴管和新生血管形成[1]。这些新生淋巴管与血管共同构成角膜的“免疫双臂”，破坏了角膜原有的免疫赦免功能而发生免疫排斥反应。Avastin(Bevaeizumab，贝伐单抗)是一种人源化的抗VEGF重组鼠单克隆抗体，能够阻止VEGF与血管内皮细胞相应的受体结合，进一步抑制血管内皮细胞的有丝分裂过程，从而阻碍新生血管的形成[2]，临床应用Avastin滴眼液治疗眼新生血管形成相关疾病已获得了良好的治疗效果[3]。VEGF-C是最早发现的具有促进淋巴管生成作用的因子，通过与受体VEGFR-3结合后，促进淋巴管内皮细胞的分化和增殖[4]。本研究通过制备小鼠碱烧伤角膜模型，结膜下注射Avastin，采用免疫组化法观察碱烧伤后不同时期小鼠角膜组织内VEGF-C的表达情况，以及角膜碱烧伤后新生淋巴管和新生血管的生成情况，探讨Avastin对角膜新生淋巴管和新生血管形成的抑制作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 建立小鼠角膜碱烧伤动物模型

取体重25～30 g，8～10周龄C57BL/6J小鼠36只，购自哈尔滨医科大学附属第二医院实验动物中心提供。将直径3 mm圆形单层滤纸浸入1 mol/L NaOH溶液中，30 s左右使滤纸达到饱和状态，吸除多余液体。小鼠0.5%利多卡因角膜局部麻醉数秒，拭去多余的药液，将3 mm圆形滤纸片置于小鼠右眼角膜中央20 sec，用生理盐水冲洗结膜囊1 min。左眼作为正常对照。

1.2 实验动物分组

小鼠角膜碱烧伤模型制备后，将36只小鼠随机分为Avastin治疗组和对照组。Avastin治疗组小鼠碱烧伤2 h后给予25 mg/mL Avastin 5 μL结膜下隔日注射及每日左氧氟沙星滴眼液滴眼3次，用药两周；碱烧伤对照组小鼠每日给予左氧氟沙星滴眼3次，用药两周。于碱烧伤后3 d、7 d和12 d处死小鼠，每个时间段6只小鼠，取出双侧眼球，4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋。

1.3 主要试剂

兔抗小鼠LYVE-1、兔抗鼠VEGF-C抗体和Avastin购自Santa Cruz公司；PV-6001试剂盒购自博士德生物公司。

1.4 免疫组化染色步骤

采用SP法，组织切片4 μm厚，常规脱蜡至水，0.3%H2O2作用10 min，目的是阻断内源性过氧化物酶活性。0.01MPBS冲洗3次，每次5 min，然后将切片放入0.01 M柠檬酸盐抗原修复液(pH=6.0)中高压2 min进行抗原修复。0.01 MPBS冲洗3次，滴加一抗(LYVE-1和VEGF-C的工作浓度均为1∶200)，4 ℃冰箱孵育12～24 h。0.01MPBS冲洗3次，滴加二抗室温孵育30 min。0.01MPBS冲洗3次，DAB显色。PBS代替一抗作为阴性对照。

1.5 结果判断和统计学方法

图像分析仪(Image-ProPlus 6.0)分析实验结果，测定免疫组化结果的光密度值(optical density,OD)。在200倍显微镜下随机观察每个时间段标本的6个视野，对染色结果进行图象分析，计算OD的均值，应用SPSS13.0统计软件对实验数据进行χ2检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 碱烧伤角膜内新生淋巴管的形成情况

在碱烧伤后7 d和12 d时间段，对照组角膜内可见LYVE-1阳性表达的新生淋巴管，淋巴管形状不规则，部分管壁不完整呈开放状态(图1)。在Avastin治疗组，碱烧伤后12d可见角膜内LYVE-1表达呈阳性的开放状态的新生淋巴管(图2)，Avastin治疗组角膜新生淋巴管出现的时间较对照组有明显延迟现象。

2.2 碱烧伤角膜内新生血管形成的观察

小鼠角膜碱烧伤后第3 d，体视显微镜下观察对照组角膜，可见到角膜新生血管生长。与对照组相比，Avastin治疗组角膜新生血管的生成较对照组少，新生血管的生长明显受到抑制(图3)。

2.3 VEGF-C免疫组化结果

正常小鼠角膜上皮细胞和角膜内皮细胞均表达VEGF-C蛋白(图4A)。在碱烧伤对照组中，碱烧伤后3 d，角膜基质层内可见大量的炎性细胞浸润，VEGF-C表达于角膜上皮细胞和炎性细胞内，表达水平较强(图4B)。碱烧伤后7 d，角膜上皮细胞和炎性细胞内VEGF-C表达(图4C)呈减弱趋势。碱烧伤后12 d，VEGF-C表达水平下降接近正常角膜VEGF-C表达的水平(见图4D)。在Avastin治疗组中，VEGF-C亦表达于角膜上皮细胞和炎性细胞内，在3 d和7 d时间段，Avastin治疗组VEGF-C的表达均低于相应时间段对照组VEGF-C的表达(图5)。

图1 碱烧伤后对照组7d和12d角膜内新生的淋巴管(箭头)×400

图2 Avastin治疗组12d角膜内新生的淋巴管(箭头)×400

图3 角膜碱烧伤对照组3d,7d和12d 角膜新生血管(A,B,C)Avastin治疗组3d,7d和12d角膜新生血管(D,E,F)

图4 正常角膜(A)和碱烧伤后对照组3 d,7 d和12 d角膜(B,C,D)内VEGF-C的表达×200

图5 Avastin治疗组3 d,7 d和12 d角膜内VEGF-C的表达(A,B,C)×200

采用图像分析软件分析角膜碱烧伤后对照组和治疗组不同时间段VEGF-C表达的光密度值，结果表明，与对照组VEGF-C的表达相比较，3 d、5 d和7 d时间段Avastin治疗组角膜VEGF-C的表达明显降低，二者之间的差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

角膜新生淋巴管和新生血管的形成与角膜炎症和角膜移植排斥反应密切相关，新生淋巴管和新生血管的形成不仅改变了角膜的“免疫赦免”的解剖特点，也是临床角膜移植排斥反应的主要原因，同时亦增加了角膜的混浊度[5]。近年随着血管和淋巴管生成因子(VEGF-C)和淋巴管内皮特异性标记物(LYVE-1)的发现，人们对角膜淋巴管生成和血管生成与VEGF-C的关系进行了深入研究[6]。VEGF-C可通过与受体VEGFR-3结合，使得VEGFR-3发生磷酸化，激活VEGF-C/VEGFR-3信号通路，诱导组织内淋巴管生成和血管生成。VEGF-C与VEGFR-3结合还可能激活多条细胞内信号传导通路，促进淋巴管和血管内皮细胞增殖、分化、迁移、抗凋亡等重要生物学行为偶联，最终形成淋巴管和血管[7]。

研究表明,人源性Avastin能够抑制VEGF与血管内皮细胞表面的受体结合，从而抑制新生血管的形成。目前，Avastin在眼科的主要应用集中于Avastin眼内注射治疗血管源性眼科疾病，例如视网膜中央静脉阻塞、糖尿病视网膜病变、新生血管性青光眼等[8]。我们的研究发现，在小鼠角膜碱烧伤对照组，烧伤后7 d的角膜基质层内可观察到大量的LYVE-1阳性表达的新生淋巴管，部分呈开放状态，部分呈不规则条索状。在Avastin治疗组，碱烧伤后12 d，可见管腔呈开放状态的淋巴管，且淋巴管的数量低于碱烧伤对照组，表明结膜下注射Avastin可延迟和减少碱烧伤角膜内新生淋巴管的形成。在角膜碱烧伤后新生血管生成方面，碱烧伤对照组小鼠角膜碱烧伤后第3 d，体视显微镜下即可见到新生血管生长进入角膜内，角膜碱烧伤后第12 d时间段，部分新生血管侵入角膜碱烧伤斑。而在Avastin治疗组，碱烧伤后第3 d，仅在角膜缘处可见到新生血管芽，碱烧伤后第12 d，可见稀疏的新生血管分布于碱烧伤斑的周边。这说明结膜下注射Avastin可显著延迟和减少角膜新生血管的形成时间和数量。本研究应用免疫组化检测证实，Avastin治疗组与碱烧伤对照组比较，VEGF-C在不同时间段的表达量均显著降低，新生淋巴管和新生血管的数量也明显减少，其机制可能是Avastin下调VEGF-C的表达或Avastin与VEGF-C结合，阻止了VEGF-C与淋巴管和血管内皮细胞表面受体结合，从而抑制了内皮细胞的有丝分裂和增殖，从而阻碍了新生淋巴管和血管的形成。预防和抑制角膜新生淋巴管和新生血管生成对降低角膜移植的排斥风险、提高角膜移植的成功率以及治疗眼科血管源性疾病等方面都具有重要的实际意义，然而角膜新生淋巴管和新生血管的形成是一个极其复杂的过程，可能需要很多因子或多条分子通路参与，因此，对角膜新生淋巴管和新生血管生成的分子机制、角膜淋巴管和血管生成与VEGF-C的确切关系还需进一步研究。

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