EP1在不明原因复发性自然流产中的作用研究*

李旭升，洪丽霞，金庆跃

(1.金华职业技术学院,浙江 金华 321017；2.上海济光职业技术学院,上海 201901)

临床上将自然状态下发生的流产称为自然流产(spontaneous abortion)。统计分析表明，在所有临床确认的妊娠中，自然流产的发生率约为15%，严重影响着广大适龄妇女的正常孕育过程[1-2]。发生在12周以前的流产定义为早期流产，妊娠12周至不足28周的流产定义为晚期流产。80%以上的自然流产发生在妊娠12周以内，随后流产率迅速下降。至少半数以上早期流产是由胚胎染色体异常所致，其他原因还包括全身性疾病、妊娠期患急性病、高热等因素[3-4]。自然流产风险随产次、父母年龄增加而升高。子宫肌层的静止和收缩的动态调控在整个妊娠过程中起着非常重要的作用，除了上述因素外，仍有诸多未知的体内、外刺激都能够引起子宫平滑肌细胞不正常的收缩，从而造成流产的发生。

前列腺素(prostaglandin，PG)是一类具有多种生理功能的活性脂质，在人体内起着非常重要的作用[5]。其中PGE2是前列腺素中非常重要的一个类型，除了在炎症中有着重要作用外，在心血管系统也被证明有着关键的功能[6]。子宫中的PGE2主要来源于子宫内膜(在妊娠过程中会发生蜕膜化)，其受体主要在肌细胞的细胞膜上表达。前列腺素能引起子宫强烈的收缩，故在足月妊娠的引产、人工药物流产以及避孕等方面取得了一定的效果[7-8]。研究表明，前列腺素E受体亚型1(EP1)在人类子宫肌层表达[9]。因此我们推测EP1表达水平的异常可能与不明原因复发性自然流产有关。但是在不明原因复发性自然流产病人中，EP1受体的分布与正常人之间的差异国内外鲜有报道，其复杂的作用机制还有待于进一步研究。本研究采用RT-PCR和免疫荧光等方法对复发性自然流产患者蜕膜组织中EP1的水平以及子宫平滑肌细胞收缩率水平进行测定，以探讨EP1在不明原因复发性自然流产中的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料

通过病例随访的方法，对在我院进行妇科保健门诊的孕妇进行随访，当出现阴道少量出血、B超提示胚胎死亡，需进行清宫者且满足以下条件者(即确诊为不明原因复发性自然流产)：发生多于2次自然流产；孕12周以内；染色体核型、妇科检查、Coombs试验、TORCH、抗心磷脂抗体检测等均无异常；无其他急慢性疾病；丈夫精液检查正常为URSA组。同期正常早期妊娠的采用吸宫术人工流产孕妇作为正常组。本次研究共收集URSA组37例，正常组48例。不明原因复发性自然流产组平均年龄(26.8±3.1)岁，平均孕期(8.9±2.2)周，未接受任何药物保胎治疗；对照组平均年龄(25.9±2.7)岁，平均孕期(9.2± 1.9)周。上述两组各项资料具可比性，差异无统计学意义。

1.2 实验材料与仪器

子宫肌膜组织通过宫腔镜活检获得，并立即进行后续子宫平滑肌细胞分离。Trizol 购自Invitrogen 公司；反转录试剂盒和SYBY Green MiX 购自全式金公司；荧光定量PCR扩增仪购自bio-rad公司；PCR引物由博尚生物公司合成。

1.3 方法

1.3.1 子宫平滑肌细胞分离与鉴定取子宫肌组织约0.5 g，置于冰冷的HBSS缓冲液中，洗净组织表面血污。于10 mL培养皿内，以眼科剪将组织剪碎成浆样，加入HBSS缓冲5 mL，转入8 mL离心管离心(2 500 g×3 min)，弃上清。组织内再加入HBSS缓冲液，吹打制成组织悬液，再次离心(2 500 g×3 min)，弃上清。重复，直至上清液变澄清。组织内加入20% FBS 2 mL，吹打，使其分散；离心(2 000 g×3 min)，弃上层液。向留下的组织内再次加入20% FBS 2 mL，吹打，再次离心(2 000 g×3 min)，弃上清。夹取组织块，点种于6 孔板(或12孔板)，块与块之间相距0.5～1.0 cm。轻轻将培养板放入37 ℃、5% CO2孵箱。4 h后，拿出培养板，向培养孔内缓慢加入20%FBS约2 mL，使液面刚好没过组织块。小心将培养板转入孵箱。前4天可不必观察。每4～6天换液1次，若有组织块漂起，可吸除之。观察至组织块之间的细胞互相融合，即可直接用于实验处理，或传代后继续培养。利用α-actin荧光抗体进行免疫荧光染色，在激光共聚焦显微镜下可看到细胞被染成绿色荧光。

1.3.2 荧光定量PCR将蜕膜组织从液氮中取出，置于1 mL Trizol 试剂中，匀浆后加入200 μL 的氯仿；对于分离的培养于六孔板的子宫平滑肌细胞，每孔中加入Trizol 试剂中，刮下细胞转移至离心管中。振荡混匀后冰上放置5 min，12 000 g离心15 min，吸取澄清部分加入等体积异丙醇中，混匀后冰上静置10 min，12 000 g 离心15 min，弃上清液，向离心管中加入1 mL预冷的75% 乙醇溶液，轻轻振荡后7 500 g离心5 min，弃上清液，沉淀用无RNA酶的双蒸水水溶解。定量后采用反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA，作为荧光定量PCR的模板。各目标分子的引物序列如下，β-actin正向引物AACGCAGCTCAACAGTCC；β-actin反向引物TGGAATCCTGTGGCATCCATG；EP1正向引物CGCAGGGTTCACGCACACGA；EP1反向引物CACTGTGCCGGGAACTACGC。引物合成后稀释为2 μM。反应体系如下：2 × SYBR Premix ExTaq 5 μL，上游引物和下游引物各1 μL，cDNA模板1∶10稀释后取1 μL，剩余用不含RNA酶的水补足，总体积10 μL。按比例配制上述反应液后分装于96 孔PCR 板，每孔10 μL，然后以500g离心1 min。PCR 反应条件如下：预变性： 95 ℃，30 s；变性： 95 ℃，3 s；退火延伸： 60 ℃，30 s；构建溶解曲线。表达量的计算采用ΔΔt 模式。

1.3.3 子宫平滑肌细胞收缩反应的测量倒置相差显微镜下，各组每检体随机观测30个细胞，每组10个检体(即300个细胞)，应用图像分析系统测量细胞长度，计算其平均长度。细胞收缩反应的变化以细胞收缩率表示。细胞收缩率=(正常组细胞平均长度-URSA组细胞平均长度)/正常组细胞平均长度×100%。siRNA处理后收缩率的计算，EP1siRNA组细胞收缩率=(正常组细胞平均长度-EP1 siRNA处理URSA组细胞平均长度)/正常组细胞平均长度×100%，阴性对照siRNA组细胞收缩率=(正常组细胞平均长度-阴性对照 siRNA处理URSA组细胞平均长度)/正常组细胞平均长度×100%。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 子宫平滑肌细胞的鉴定

通过免疫荧光的手段，我们对分离出的子宫平滑肌细胞进行鉴定，利用平滑肌细胞特异性的标志物α-平滑肌细胞激动蛋白(α-SMA)进行鉴定，结果分析分离的细胞平滑肌细胞阳性率高于90%，见图1。

图1 子宫平滑肌细胞鉴定

2.2 URSA组和正常组子宫平滑肌细胞中EP1表达

子宫内膜分泌的PGE2会作用于分布在子宫平滑肌细胞上EP受体，EP受体进而介导不同的信号通路，通过第二信使对子宫平滑肌细胞的生理活动产生影响。利用RT-PCR的方法，我们分析了URSA组和正常组子宫平滑肌细胞中EP1的表达情况。实验结果采用ΔΔt 模式进行分析，结果显示EP1的表达有了显著上升，差异有统计学意义(P<0.01)，见图2。

图2 EP1表达水平

2.3 URSA组和正常组子宫平滑肌细胞收缩率

与正常组相比较，URSA组平滑肌细胞收缩率增强，且有明显差异，P<0.01，见表1。这显示在URSA组中，平滑肌细胞不正常的收缩可能是导致自然流产发生的一个重要因素。

表1 URSA组和正常组子宫平滑肌细胞收缩情况

2.4 EP1 siRNA处理对URSA组子宫平滑肌细胞收缩率的影响

我们分别用阴性对照siRNA和EP1特异性siRNA处理URSA组子宫平滑肌细胞，结果显示，阴性对照siRNAEP1处理子宫平滑肌细胞收缩率为27.58%，而特异性 siRNA处理子宫平滑肌细胞收缩率为13.21%，能够显著降低URSA组子宫平滑肌细胞不正常的收缩，差异有统计学意义(P<0.05)。提示EP1可能在子宫平滑肌细胞不正常的收缩中起重要的作用。

3 讨论

不明原因复发性自然流产是严重影响适龄妇女正常生育的一个重要因素，随着环境以及其他因素的日益复杂化，越来越多的复发性自然流产发生，并且无法确诊出具体的原因，给孕妇心理和身体造成了极大的损伤，目前已经成为临床研究的焦点。其中平滑肌细胞异常的静止和收缩都是造成自然流产发生的重要原因[10-12]，在体外研究子宫平滑肌细胞功能，寻找改善子宫平滑肌细胞收缩稳态的靶点被证明是一个有效的研究思路。

前列腺素及其受体被证明在人体内发挥着及其重要的作用，前列腺素E在平滑肌功能调节中有着重要的作用，起在体内有着四个亚型的受体EP1，EP2，EP3，EP4[13]。其中EP1受体的激活能够导致平滑肌细胞的收缩，属于收缩型或兴奋性受体[14]。EP1能够偶联细胞内钙信号，而钙信号被证明能够促进平滑肌细胞的收缩特性。研究发现EP1受体在血管平滑肌细胞中具有重要功能[15]。

我们的研究发现，在不明原因复发性自然流产病人的子宫平滑肌细胞中，EP1受体的表达水平显著上升，同时不明原因复发性自然流产病人子宫平滑肌细胞具有异常的收缩的现象，我们利用特异性siRNA敲降EP1受体后发现EP1的敲降能够明显减低子宫平滑肌细胞的收缩，并且提高子宫平滑肌细胞的收缩和静止之间的稳定。其具体的内在分子机制可能是通过体内第二信使钙离子实现的，具体的机制值得进一步的研究。

总之，EP1受体对子宫平滑肌细胞功能的影响，使其能够作为不明原因复发性自然流产的一个靶点，为不明原因复发性自然流产的诊断和治疗提供理论依据。

[1] 凌纬联，张传仓，李雁，等.我国五城市已婚育龄妇女自然流产因素分析[J].中国初级卫生保健，2004，18(9)：49-52.

[2] 刘宝，高尔生.中国已婚育龄妇女自然流产的危险因素分析[J].中国公共卫生，2002(7)： 126-128.

[3] 刘欣燕，边旭明，韩京秀，等.早期自然流产孕妇生活环境中的危险因素[J].中国医学科学院学报，2007，29(5)：661-664.

[4] 徐广立.环境与基因的交互作用对早期自然流产的影响[D].郑州：郑州大学，2014.

[5] KRINGELHOLT S，SIMONSEN U，TOKE Bek.Dual effect of prostaglandins on isolated intraocular porcine ciliary arteries[J].Acta Ophthalmol，2013,91(6)：498-504.

[6] SCHLAGENHAUF A.Prostaglandin E2levels and platelet function are different in cord blood compared to adults[J].Thromb Haemost，2015,113(1)：97-106.

[7] 廖聪.宫颈扩张球囊与前列腺素类制剂促宫颈成熟引产效果比较[J].现代仪器与医疗，2016,22(2)：78-80.

[8] 刘海彬.蓖麻油引产餐提取物影响子宫收缩和羊膜组织前列腺素E2的含量[J].中国组织工程研究，2015,19(49)：8032-8036.

[9] 柯小平.COX-2及钙离子通道蛋白与子宫肌瘤发病机制间的关系研究[D].济南：山东大学，2014.

[10] 谷春会，复发性流产186例危险因素分析[D].长春：吉林大学，2014.

[11] 吴再归，游泽山，张彩，等.转录因子FOXP3基因多态性与不明原因复发性自然流产的易感性研究[J].实用妇产科杂志，2011,27(8)：587-591.

[12] 张瑶.中西医结合治疗复发性流产的临床观察[D].北京：北京中医药大学，2013.

[13] IWANAGA K.Prostaglandin E2promotes wound-induced migration of intestinal subepithelial myofibroblasts via EP2，EP3，and EP4 prostanoid receptor activation[J].J Pharmacol Exp Ther，2012,340(3)：604-611.

[14] SMIND S D,SEVENSSON K M.Inhibition of cyclooxygenase-2 and EP1 receptor antagonism reduces human colonic longitudinal muscle contractility in vitro[J].Prostaglandins Other Lipid Mediat，2009,88(3-4)： 117-121.

[15] JADHAV V.EP1-and EP3-receptors mediate prostaglandin E2-induced constriction of porcine large cerebral arteries[J].J Cereb Blood Flow Metab，2004,24(12)：1305-1316.