大肠杆菌外膜蛋白OmpC的生物信息学分析及表位多肽疫苗的重组预测

俱 雄，党亚锋，刘 祥，丁 锐，陈 琛，冯自立，张辰露

(1.陕西理工大学中德天然产物研究所，陕西 汉中 723001； 2.汉中市食品药品检验检测中心, 陕西 汉中 723000；3.陕西省天麻山茱萸工程技术研究中心，陕西 汉中 723001)

大肠杆菌外膜蛋白OmpC的生物信息学分析及表位多肽疫苗的重组预测

俱 雄1，3，党亚锋1，2，刘 祥1,3，丁 锐1,3，陈 琛1,3，冯自立1,3，张辰露1,3

(1.陕西理工大学中德天然产物研究所，陕西 汉中 723001； 2.汉中市食品药品检验检测中心, 陕西 汉中 723000；3.陕西省天麻山茱萸工程技术研究中心，陕西 汉中 723001)

为设计大肠杆菌外膜蛋白OmpC的表位多肽重组疫苗，进一步提高OmpC蛋白的免疫效果，通过生物信息学软件对OmpC蛋白的进化关系、高级结构与细胞表位进行分析。结果表明，大肠杆菌、沙门伤寒菌 、肺炎克雷伯菌，这3种细菌具有较高同源性，OmpC蛋白可能对这3种菌株的感染起到交叉免疫保护作用。OmpC为亲水性蛋白，1～21位氨基酸为信号肽位置，无跨膜结构并定位于细胞膜外；OmpC二级结构中含无规则卷曲43.05%，a-螺旋16.08 %，β-转角0 %，β-片层40.87 %。OmpC蛋白可能存在5个优势B细胞表位，1个CTL表位，1个Th细胞表位；并重组拼接获得抗原性较好的OmpC蛋白表位多肽。

大肠杆菌；OmpC蛋白；表位疫苗；抗原分析

大肠杆菌为革兰氏阴性菌，广泛存在于自然界中，可经口腔进入消化道，感染人类和动物肠道，导致腹泻和败血症[1]，是一种重要的人畜共患病源菌[3]。尤其是大肠杆菌诱发的奶牛乳房炎[2]，严重影响奶制品质量，给奶制品业造成巨大经济损失。目前，针对大肠杆菌感染的防治主要是利用抗生素，伴随着抗生素的大量使用，难免导致药物残留影响奶制品品质，以及耐药菌株的产生[4-5]。因此，有必要提出一种新的方法治疗大肠杆菌疾病。研究发现大肠杆菌抗原性较好的蛋白主要有OmpC蛋白[6]、OmpA蛋白[7]、OmpT蛋白[8]、OmpF蛋白[9]、OmpW蛋白[10]等，尤其是OmpC蛋白具有很好的免疫保护作用，可以激发机体的体液免疫和细胞免疫，能有效抵抗大肠杆菌对机体的感染[11]，是一种很好的候选疫苗蛋白。本研究通过生物信息学方法，对大肠杆菌OmpC蛋白进行进化关系、理化性质、高级结构，以及细胞表位进行分析，并设计重组表位多肽疫苗，以期进一步提高OmpC蛋白的免疫作用，为OmpC表位疫苗的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

大肠杆菌OmpC氨基酸序列来源于NCBI网站公布，登陆号: ADU34074.2，序列如下：MKVKVLSLLVPALLVAGAANAAEVYNKDGNKLDLYGKVD-GLHYFSDDKSVDGDQTYMRLGFKGETQVTDQLTG-YGQWEYQIQGNSAENENNSWTRVAFAGLKFQDV-GSFDYGRNYGVVYDVTSWTDVLPEFGGDTYGSDNFMQQRGNGFATYRNTDFFGLVDGLNFAVQYQGK-NGSVSGEGMTNNGRDALRQNGDGVGGSITYDYEGFGIGGAISSSKRTDAQNTAAYIGNGDRAETYTGGL-KYDANNIYLAAQYTQTYNATRVGSLGWANKAQN-FEAVAQYQFDFGLRPSVAYLQSKGKNLGTIGTRNYDDEDILKYVDVGATYYFNKNMSTYVDYKINLLDD-NQFTRDAGINTDNIVALGLVYQF。

1.2 方法

1.2.1 进化关系分析 依据NCBI网站公布的不同菌株OmpC蛋白序列，利用DNAMAN软件进行同源性分析，并采用MEGA软件构建不同菌株的系统进化树。

1.2.2 理化性质分析 采用ProtParam软件对大肠杆菌OmpC蛋白进行亲水性、等电点、氨基酸数、稳定性、半衰期进行预测分析，利用ProtScale analysis获得亲水性图谱。

1.2.3 信号肽、跨膜结构分析 利用Signal P 4.1和TMHMM v. 2.0软件分别对OmpC进行信号肽和跨膜结构预测。

1.2.4 二级、三级结构预测 通过SOPMA和SWISS在线预测软件，对大肠杆菌OmpC蛋白分别进行二级、三级结构预测。

1.2.5 蛋白相互作用网络分析 采用String蛋白相互作用预测网站，预测大肠杆菌OmpC与其他蛋白的相互作用关系网络。

1.2.6 细胞表位分析 利用BepiPred 1.0b和ABCpred 2种方法对大肠杆菌OmpC蛋白进行B细胞表位预测，综合2种方法的共同序列，获得B细胞表位肽段。通过人工神经网络法ComPred和Peptide对大肠杆菌OmpC分别进行CTL表位、Th表位预测。

1.2.7 串联表位重组 将预测获得的B/T细胞表位按照B细胞表位、CTL细胞表位及Th细胞表位顺序进行编号，各个表位间以4个甘氨酸(GGGG)进行柔性分割，然后利用DNAstar软件对获得的B/T表位肽段进行不同排列组合优化，找出抗原性好的排列组合作为最终的重组表位多肽。

2 结果与分析

2.1 大肠杆菌OmpC蛋白进化关系分析

通过DNAMAN软件对不同菌株的OmpC蛋白进行同源性分析(如图1)，发现大肠杆菌、沙门伤寒菌、肺炎克雷伯菌3种菌株的亲缘关系更近。利用MEGA软件构建系统进化树(如图2)，可见大肠杆菌、沙门伤寒菌 、肺炎克雷伯菌进化距离都小于0.1，亲缘关系相对于其他菌株更近。因而，大肠杆菌、沙门伤寒菌 、肺炎克雷伯菌这3种细菌的OmpC蛋白序列具有较高同源性，其产生的抗体可能对这3种菌株的感染起到交叉免疫保护作用。

2.2 大肠杆菌OmpC理化性质分析

通过ProtParam在线预测软件对OmpC进行理化性质预测。结果发现OmpC相对分子质量为40 371.1，等电点4.58，半衰期均为30 h，脂肪族系数67.77；蛋白稳定系数12.26，为稳定蛋白；平均疏水性均-0.511，为亲水性蛋白(图3)。

2.3 大肠杆菌OmpC信号肽及跨膜结构预测

采用Signal P 4.1软件对OmpC进行信号肽预测(图4)，结果显示1～21多肽可能为信号肽序列(图4-A)。通过TMHMM v. 2.0软件进行跨膜结构预测，发现OmpC位于细胞膜外；1～23位氨基酸跨膜结构可信度值为0.26；而1～21位为信号肽序列，可能被剪切。因此可推测出OmpC无跨膜结构。

图1 OmpC蛋白氨基酸序列同源性分析Fig.1 Homology analysis for amino acid sequence of OmpC

图2 大肠杆菌OmpC系统进化树Fig.2 Phylogenetic tree of E.coli OmpC protein

图3 大肠杆菌OmpC蛋白亲水性分析Fig.3 Hydrophilcity analysis of E.coli OmpC protein

2.4 大肠杆菌OmpC蛋白二级、三级结构预测

大肠杆菌OmpC蛋白二级结构预测采用SOPMA方法，预测可信度为82%， a-螺旋氨基酸所占比例为16.08 %，β-转角为0.00%，无规则卷曲为43.05 %，β-片层为40.87 %(图5)，表明OmpC蛋白大部分氨基酸序列呈无规则卷曲状态，为细胞表位的产生奠定基础。

通过SWISS在线预测软件对大肠杆菌OmpC三维结构进行分析(图6-A)，模型覆盖率为100%，波形图稳定，可靠性较高(图6-B)。结果发现OmpC三维结构与二级结构具有一致性。

图4 大肠杆菌OmpC信号肽及跨膜区的预测Fig.4 The prediction of signal peptide and transmembrane structure of E.coli OmpC protein

c：无规则卷曲；e：β-片层；h：α-螺旋； t：β-转角c: Random coil; e: Extended strand; h: Alpha helix; t: Beta turn

图6 大肠杆菌OmpC三级结构预测Fig.6 Tertiary structure prediction of E.coli OmpC protein

2.5 大肠杆菌OmpC蛋白作用网络分析

通过String方法对大肠杆菌OmpC进行预测，结果如图7所示。10种蛋白与大肠杆菌OmpC存在相互作用，其中DegP蛋白、OmpA蛋白及OmpR蛋白与OmpC蛋白作用更为紧密。

图7 大肠杆菌OmpC相互作用蛋白预测Fig.7 Protein-protein interaction prediction of E.coli OmpC protein

2.6 大肠杆菌OmpC蛋白B细胞表位预测

通过BepiPred 1.0b方法预测大肠杆菌OmpC蛋白B细胞表位(表1)。通过人工神经网络ABCpred方法，对大肠杆菌OmpC进行B细胞表位预测(表2)。综合2种方案的共同表位序列，最终获得OmpC蛋白B细胞优势表位区段为：74-90，129-144，146-152，178-194，213-227。

2.7 大肠杆菌 OmpC蛋白T细胞表位预测

2.7.1 OmpC蛋白CTL表位预测 通过人工神经网络法软件ComPred对大肠杆菌OmpC进行CTL表位预测，选用HLA-A2，HLA-A*0201，HLA-A*0202，HLA-A*0203，HLA-A*0205 不同结合肽类型(表3)。综合共同序列分析，获得OmpC的CTL表位为291-299的GLRPSLAYL。

2.7.2 OmpC蛋白Th表位预测 使用软件Peptide对大肠杆菌OmpC进行Th表位预测，选用DRB1-0101、DRB1-0102、DRB1-0301 3种不同多肽类型，结果如表4所示。综合共有肽段，分析获得OmpC的Th表位为212-220的FGIGGAISS。

表1 BepiPred 1.0b预测大肠杆菌 OmpC 蛋白 B 细胞表位的肽段位置Table 1 B cellepitopes for E.coli OmpC protein by BepiPred 1.0b method

表2 ABCpred预测大肠杆菌OmpC蛋白B细胞表位的肽段位置Table 2 B cellepitopes for E.coli OmpC protein by ABCpred method

表3 大肠杆菌OmpC CTL表位预测Table 3 The CTL epitope prediction of OmpC in E.coli

2.8 大肠杆菌串联表位的重组

对获得B/T细胞表位进行顺序编号，表位间加入4个甘氨酸(GGGG)作为柔性片段，通过DNAStar软件优化不同排列组合，最终获得抗原性较好的串联表位顺序为：epitope 5-epitope 2-epitope 4-epitope 7-epitope 6-epitope 1-epitope 3，如图8所示。转化成氨基酸序列为：AISSSKRTDAQNTAAGGGGYDVTSWTDVLPEFGGDGGGGVQ-YQGKNGSVSGEGMTNGGGGFGIGGAISSGGGGGL-RPSLAYLGGGGETQVTDQLTGYGQWEYQGGGGYG-SDNFM(下划线为柔性片段)。翻译的核酸序列为：GCGATCTCCAGCTCCAAACGTACTGATGCTCAGAACACCGCTGGGTGGCGGTGGCCCAGAATTCGGTGG-CGACACTTACGGTTCTGACAACTTCATGCAGCGGTGGCGGTGGCAGCGGCGAAGGCATGACCAACAACGGTCGTGATGCTCTGCGTCAGAACGGGTGGCGGTGGCGGTGCGATCTCCAGCTCCAAACGTAGGTGGCGGTGGCTCTGTAGCATACCTGCAGTCTAAAGGGTGGCGGTGGCTACGGCCAGTGGGAATATCAGATCCAGGG-CAACAGCGCTGAAAACGAAAGGTGGCGGTGGCGGTAACGGCTTCGCGACCT(下划线为柔性片段核酸序列)。

表4 大肠杆菌OmpC Th抗原表位预测Table 4 The Th epitopes prediction of E.coli OmpC protein

图8 重组多肽抗原指数分析Fig.8 Antigenic index of recombination polypeptide

3 结论与讨论

生物信息学可实现蛋白进化关系、理化性质与高级结构的准确预测[12]，尤其对蛋白细胞表位的预测、设计，可减少试验的盲目性，提高试验效率，为重组表位疫苗的研制提供理论指导[12]。本研究通过生物信息学方法，对大肠杆菌OmpC蛋白的进化关系、理化性质、高级结构、相互作用网络与细胞表位，以及串联重组表位进行预测。遗传进化关系显示大肠杆菌与沙门伤寒菌，肺炎克雷伯菌亲缘关系最近，OmpC蛋白对这3种菌的感染可能存在交叉免疫保护作用；通过理化性质预测得到OmpC为亲水性蛋白，无跨膜结构，存在信号肽序列，定位于细胞膜外，为分泌性蛋白。OmpC蛋白的高级结构预测发现无规则卷曲占有较高比例，而无规则卷曲易于产生盘旋、扭曲，暴露于蛋白外层，常含有优势的细胞抗原表位[13]，这为细胞表位预测提供了依据。

目前，预测蛋白 B 细胞表位的常用方法有BepiPred 和ABCpred。BepiPred 方法主要是利用隐形马尔可夫模型以及氨基酸的特定性质进行线性表位的预测[14]; ABCpred软件主要是基于人工神经网络算法，准确率较高[15]。曾少灵等[16]采用ABCpred 方法对小反刍兽疫病毒N蛋白羊脓进行了B细胞表位预测，闫晶晶等[17]通过 BepiPred 和ABCpred 2种方案对人巨细胞病毒包膜糖蛋白进了B细胞表位预测。本研究结合BepiPred 和 ABCpred 2种方案，对OmpC蛋白进行B细胞表位预测，并利用 OmpC 蛋白二级结构预测结果，选取抗原性较好的无规则卷曲位置作为B细胞表位序列，最终获得OmpC蛋白B细胞表位为: 74-90，129-144，146-152，178-194，213-227。这为串联表位疫苗的设计提供了理论依据。

CTL 表位预测的方法较多，常见方法包含IEDB、SYFPEITHI和IMTECH 等[18-19]。时冉冉等[20]利用在线软件，采用人工神经网络法成功预测肿瘤抗原PIWIL2蛋白 CTL 表位。本研究采用人工神经网络法及量化矩阵法对 OmpC 蛋白的 CTL 表位预测。结果获得 OmpC 蛋白CTL 表位为: 291-299的GLRPSLAYL。这些 OmpC 蛋白的CTL表位可能与 MHC-Ⅰ类分子相结合，经过抗原呈递，从而激活CTL 细胞免疫作用[20]。

Th 表位预测方法在细菌蛋白[19]、病毒蛋白[21]上均有研究。本研究通过选取3 类不同等位基因的Th表位进行预测，获得OmpC 蛋白的 Th 表位为：212-220的FGIGGAISS。这些 OmpC蛋白的表位序列可能与 MHC -Ⅱ类分子结合，进一步增强机体的免疫反应[22]。

表位疫苗是近年来发展起来的一种新型疫苗，与传统疫苗相比具有能被多种遗传背景的MHC分子识别优势[23]，在HIV-1病毒[24]、结核杆菌[25]、黑色素瘤[26]、人乳头瘤病毒[27]、乙型肝炎病毒[28]等病原菌上均有研究。然而，重组表位疫苗的开发还处于初始阶段，且存在诸多问题需要解决，如：更加有效的表位筛选方法的建立，表位疫苗的开发等。本研究通过成熟的蛋白B/T细胞表位预测方法，设计了大肠杆菌OmpC蛋白表位疫苗，而表位疫苗的免疫学功能则有待进一步验证。

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(责任编辑：朱秀英)

Bioinformatic analysis ofE.coliOmpC and recombinant prediction of epitope peptide vaccine

JU Xiong1，3, DANG Yafeng1，2, LIU Xiang1,3, DING Rui1,3, CHEN Chen1,3, FENG Zili1,3, ZHANG Chenlu1,3

(1.Chinese-German Joint Institute for Natural Product Research, Shanxi Sci-Tech University,Hanzhong 723001, China; 2. The Food and Drug Inspection and Testing Center of Hanzhong City, Hanzhong 723000, China; 3.Shanxi Engineering Research Center for Tall Gastrodia Tuber and Medical Dogwood, Hanzhong 723001, China)

In order to improve the immune effect of OmpC (outer membrane protein C) protein, the recombinant vaccine ofEscherichiacoliOmpC epitope polypeptide was designed. By bioinformatic software, the evolution relationship, advanced structure and cell epitopes of OmpC protein were analyzed. The results showed that the OmpC protein sequences ofEscherichiacoli,Salmonella,Klebsiellapneumoniae, had high homology, and OmpC antibodies might play a cross immune protective effect for these strains. OmpC was a hydrophilic protein, 1～21 amino acids of OmpC was signal peptide sequence, and had not transmembrane structure being located outside the cell membrane.The OmpC secondary structure contained 43.05% of random coil,16.08% of alpha helix,0% of beta turn, and 40.87% of extended strand,respectively. OmpC might have 5 B-cell epitopes, 1 CTL epitopes, and 1 Th epitopes, and OmpC protein epitope vaccine with good immunogenicity was obtained by recombinant splicing.

Escherichiacoli; OmpC protein; epitope vaccine; antigenic analysis

2016-05-13

陕西省农业科技创新与攻关项目(2016NY-088)；陕西理工大学校级科研项目( SLGKY16-13)

俱 雄(1990-)，男，陕西咸阳人，硕士研究生，主要从事蛋白质组学与免疫学研究。

刘 祥(1983-)，男，安徽合肥人，副教授，博士，硕士生导师。

1000-2340(2017)01-0094-07

Q816

A