子宫颈鳞癌中MK、p63α的表达及临床意义

方慧英，黄永平，李爱霞

子宫颈鳞癌中MK、p63α的表达及临床意义

方慧英，黄永平，李爱霞

目的 探讨MK、p63α在正常子宫颈鳞状上皮和子宫颈鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma, SCC)组织中的表达及其意义。方法 采用免疫组化SP法检测30例正常子宫颈鳞状上皮和98例子宫颈SCC组织中MK、p63α的表达，并分析两者表达的相关性及与临床病理特征、预后的关系。结果 MK在正常子宫颈鳞状上皮组织中几乎不表达，在子宫颈SCC组织中的高表达率与低表达率分别为28.6%和38.8%；p63α在正常子宫颈鳞状上皮组织中高表达率与低表达率分别为73.3%和16.7%，在子宫颈SCC组织中高表达率与低表达率分别为34.7%和45.9%，差异有统计学意义(P<0.01)。p63α和MK在子宫颈SCC组织中的表达呈负相关(rs=-0.372，P<0.01)；p63α和MK表达与患者年龄、肿瘤直径和组织分化有相关性(P<0.05)，与临床分期、淋巴结转移无相关性(P>0.05)。MK高表达患者的生存期显著低于阴性患者；p63α阴性患者生存率显著低于高表达患者。结论 MK、p63α表达与子宫颈癌的发生、发展密切相关，联合检测两者有助于子宫颈癌预后的判断。

子宫颈肿瘤；MK；p63α；免疫组织化学

子宫颈癌是全球常见的女性生殖系统恶性肿瘤之一，近年其发病呈年轻化趋势。子宫颈癌的发生、发展是多因素、多阶段长期作用的过程，鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma, SCC)是子宫颈癌最主要的病理类型，分析子宫颈SCC发生、发展的分子机制，并对其进行干预，有助于提高患者的生存率和生存质量。中期因子(midkine, MK)是一种肝素结合生长和分化因子，与多种肿瘤的发生、发展有关，可能在肿瘤血管形成中起重要作用，国外有学者主张检测MK作为恶性肿瘤的筛查和随访指标[1-2]。p63也与肿瘤的侵袭、转移以及预后密切相关[3]。本文采用免疫组化SP法检测MK、p63α在正常子宫颈鳞状上皮和子宫颈SCC组织的表达，探讨两者表达的相关性及与子宫颈癌临床病理特征的关系。

1 材料与方法

1.1 临床资料 选取安徽医科大学附属省立医院妇产科2008年1月～2011年3月收治的98例子宫颈SCC患者，年龄30～68岁，中位年龄45岁。依据1994年FIGO分期标准，Ⅰ期59例，Ⅱ期39例，所有患者术前均未接受任何辅助治疗且随访资料完整。另选取同期30例行全子宫切除的子宫肌瘤或子宫腺肌症患者的正常子宫颈上皮组织，年龄25～62岁，中位年龄44岁，两组间患者年龄差异无统计学意义。

1.2 试剂 抗原修复液、PBS缓冲液、DAB(ZLI-9049)显色剂、苏木精、中性树脂、通用性二抗，均购自北京中杉金桥公司。p63α鼠抗人单克隆抗体购自英国Abcam公司，MK鼠抗人单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司。

1.3 方法 组织蜡块2 μm厚连续切片，展铺于玻片上干燥后，置于60 ℃恒温烤箱烘烤12 h；切片常规脱蜡，置于pH 8.6的枸缘酸钠溶液中高压抗原修复，270 ℃煮沸，喷气后计时2 min后立即关火，室温下冷却；自来水冲洗，置于3% H2O2溶液8 min，自来水冲洗，PBS溶液浸泡5 min；滴加一抗，4 ℃过夜，PBS冲洗；滴加生物素标记的二抗，室温下作用30 min，PBS冲洗；DAB显色，苏木精复染，中性树胶封固。由三位病理医师采用盲法对免疫组化结果进行评估。显微镜下每张切片随机选取5个视野，根据每个视野中阳性细胞数占总上皮细胞数的百分比和染色深浅进行评分。阳性细胞数判断：阳性细胞≤10%为1分，11%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分；染色强度评分：无阳性着色为0分，淡黄色为1分，黄色为2分，深黄色或棕黄色为3分。两项相乘采用半定量积分：0分为阴性，1～4分为低表达，>4分为高表达。

1.4 随访 采用电话、门诊复查等方式随访，次数不限。患者生存时间以手术日始，截止日期为2016年7月，失访5例，中位随访时间为48个月(6～102个月)，子宫颈癌死亡10例，其中Ⅰ期患者7例，Ⅱ期患者3例。

1.5 统计学处理 采用SPSS 23.0软件进行统计学分析，各蛋白的表达水平与临床病理特征间关系采用Mann-whitneyU检验或Kruskal-wallis秩和检验，各蛋白之间的相关性分析采用Spearman等级相关检验，各蛋白表达对患者生存率的影响采用Kaplan-Meier法分析，生存率曲线的比较采用Log-rank检验方法。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MK与p63α蛋白在正常子宫颈鳞状上皮、SCC组织中的表达 正常子宫颈鳞状上皮组织中MK几乎不表达；MK在子宫颈SCC组织中主要表达在细胞质和细胞核，呈黄色或棕黄色，在子宫颈SCC组织中高表达率与低表达率分别为28.6%(28/98)、38.8%(38/98)；结果显示子宫颈SCC组中MK的表达高于正常子宫颈鳞状上皮组，差异有统计学意义(P<0.01，表1，图1)。p63α主要表达在细胞核中，呈棕黄色或棕褐色颗粒状染色，在正常子宫颈鳞状上皮组中高表达率与低表达率分别为73.3%(22/30)、16.7%(5/30)；在子宫颈SCC组中高表达率与低表达率分别为34.7%(34/98)和45.9%(45/98)；结果显示p63α在子宫颈SCC组中的表达明显低于正常子宫颈鳞状上皮组，差异有统计学意义(P<0.01，表1，图1)。

ABCD

图1 MK和p63α在正常子宫颈鳞状上皮及子宫颈SCC组织中的表达，SP法：A.MK高表达；B.p63α低表达；C.MK低表达；D.p63α高表达

2.2 子宫颈SCC组织中MK与p63α表达的相关性 在98例子宫颈SCC组织中，22.5%(22/98)的癌组织呈p63α高表达，MK阴性；23.5%(23/98)呈p63α和MK共同低表达；7.1%(7/98)呈p63α阴性、MK高表达；16.3%(16/98)呈p63α低表达、MK高表达，采用Spearman检验p63α和MK的表达相关性，相关系数为-0.372，两者呈负相关(P<0.01，表2)。

2.3 p63α和MK蛋白表达与子宫颈SCC临床病理特征相关性 子宫颈癌组织中p63α、MK表达与患者年龄、肿瘤大小、组织分化有相关性，差异有统计学意义(P<0.05)；两种蛋白表达与临床分期、淋巴结转移无相关性，差异无统计学意义(P>0.05，表3)。

2.4 MK和p63α蛋白表达与子宫颈SCC患者预后的相关性分析 对98例子宫颈SCC患者进行随访，其中失访5例，死亡10例，5年生存率89.8%。子宫颈SCC患者中MK高表达患者病死率为28.6%(8/28)，低表达患者病死率为5.3%(2/38)，阴性患者病死率为0(0/32)。p63α高表达患者病死率为5.9%(2/34)，低表达患者病死率4.4%(2/45)，阴性患者病死率31.6%(6/19)。分别对MK和p63α进行Log rank检验，提示两种蛋白的表达水平不同，生存率有统计学意义(χ2=15.85、24.90，P<0.01，图2)。

图2 A.MK蛋白不同表达水平的Kaplan-Meier生存曲线；

分组nMK阴性低表达高表达χ2值P值p63α阴性低表达高表达χ2值P值正常子宫颈鳞状上皮30254122．370．000∗352211．160．001∗子宫颈SCC98323828194534

*P<0.05

表2 子宫颈SCC组织中MK和p63α蛋白表达的相关性

*P<0.05

3 讨论

MK是一种分泌型的碱性肝素结合蛋白，成熟的人MK蛋白相对分子质量1.3×104，富含碱性氨基酸残基和半胱氨酸残基，MK能促进细胞有丝分裂和增殖、血管生成、增强纤溶酶原激活剂活性、诱导细胞恶性转化，参与炎症修复和肿瘤浸润，从而影响肿瘤细胞的增殖、分化、凋亡和迁移[4-6]，其中，MK通过激活ER或PI3激酶途径抑制Caspase 3激活，从而抑制细胞凋亡，MK还通过调节Akt、ERK1/2途径促进肿瘤的生长。MK具有抗药蛋白的作用，高表达MK的肿瘤细胞系对化疗药物的抵抗性明显增强，并且这种抗性具有邻近效应，耐药细胞通过分泌MK分子作用于其周围的药物敏感细胞，使肿瘤整体具有抗药性[7-8]，MK在正常组织中不表达或低表达，在很多恶性肿瘤中表达增强，包括Wilms瘤、胃癌、结直肠癌、神经母细胞瘤、前列腺癌、膀胱癌、肺癌等，高表达MK患者的预后相对于低表达患者差[9]，本实验中MK高表达的子宫颈SCC患者生存期显著低于阴性者。

p63属于p53家族成员，在各种上皮组织的发育、分化和形态中发挥重要作用。p63根据N端的剪切方式不同分为TAp63和ΔNp63；根据C端的剪切方式不同，分为p63α、β、γ、δ、ε[3]，而在子宫颈癌等鳞状上皮肿瘤中，以ΔNp63α亚型表达为主，其很可能是子宫颈SCC分化的敏感指标之一，p63在子宫颈高分化SCC中高表达，而在中、低分化子宫颈SCC中表达显著降低[10]。p63表达水平高的肿瘤患者预后相对较好[11]。上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是上皮细胞获得有效迁移能力的主要方式，ΔNp63α的丧失会导致EMT的发生，增加上皮细胞恶性生物学行为。p63α在发生EMT的子宫颈癌组织中低表达，在未发生EMT的组织中表达水平相对较高，低表达ΔNp63α的患者发生肿瘤转移和复发的危险性更高、预后也更差，过表达ΔNp63α能抑制细胞的转移和侵袭能力[12]。本实验中p63α高表达的子宫颈SCC患者生存期显著高于阴性者，提示p63α可作为判断预后的指标。

本实验结果表明，在子宫颈SCC中MK与p63α的表达呈负相关(rs=-0.372，P<0.01)，在子宫颈SCC组织中MK的表达高于正常子宫颈鳞状上皮组，p63α在子宫颈SCC组织中的表达明显低于正常子宫颈组织(P<0.01)。Moon等[13]发现子宫颈癌组织中MK的mRNA和蛋白的表达均高于正常对照组，且其程度与肿瘤大小、临床分期有关，也有学者指出MK在子宫颈癌中高表达且与肿瘤分级相关[14]。在本实验中，两种蛋白的表达与组织分级、肿瘤大小和年龄显著相关(P<0.05)，与临床分期及淋巴结转移无相关性，推测也可能是样本量不足导致本组统计分析MK表达与子宫颈癌临床分期无相关性。

鉴于MK与p63α均参与调控子宫颈癌的发展和预后，本组利用免疫组化SP法检测两者在子宫颈SCC中的表达，对其临床病理特征和预后进行分析，并进一步探讨两者表达的相关性。结果显示两者呈负相关，推测MK与p63α可能协同调节子宫颈癌的发展。因此，进一步分析两者的调控关系有助于阐明子宫颈癌的发展机制，为改善子宫颈癌的预后提供重要线索。

表3 MK、p63α与子宫颈SCC临床病理特征的比较分析

*P<0.05

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安徽省高等学校自然科学研究项目资助(KJ2015A375、KJ2016A249)、安徽省高校省级质量工程项目(2016 jxtd044)

安徽人口职业学院护理系妇产科教研室，池州 247099

方慧英，女，硕士，副教授。E-mail：1749324992@qq.com

时间：2017-5-17 23:54 网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170517.2352.026.html

R 737.33

B

1001-7399(2017)05-0573-04

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.05.026

接受日期：2017-03-15