钩吻毒理学与检测方法的研究进展

姬圣洁，刘 伟

（1.司法部司法鉴定科学技术研究所 上海市法医学重点实验室 上海市司法鉴定专业技术服务平台，上海200063；2.复旦大学基础医学院法医系，上海200032）

鉴定综述R e v iew

钩吻毒理学与检测方法的研究进展

姬圣洁1，2，刘 伟1

（1.司法部司法鉴定科学技术研究所 上海市法医学重点实验室 上海市司法鉴定专业技术服务平台，上海200063；2.复旦大学基础医学院法医系，上海200032）

钩吻为马钱科胡蔓藤属植物胡蔓藤的全株，主要化学成分为吲哚类或氧化吲哚类生物碱，是其发挥药理活性和产生毒性的主要来源。由于钩吻的治疗量与中毒量相近，因使用不当、自杀或者恶意投毒等原因造成钩吻中毒的事件时有发生，临床上对人的消化系统、神经系统、循环和呼吸系统造成不同程度的损害，严重者最终因呼吸麻痹而死亡。因此，通过结合国内外研究现状，归纳总结了钩吻的化学成分、毒理学、药物动力学和检测方法等方面的内容，以期为钩吻中毒的法医学鉴定和临床诊治提供参考和帮助。

钩吻；生物碱；毒理学；检测方法

钩吻，又名胡蔓藤、大茶药、断肠草、毒根、野葛等，是马钱科（Loganiaceae）胡蔓藤属植物胡蔓藤的全株。胡蔓藤属植物共有三种，根据产地不同可分为两类：一类是北美钩吻，包括常绿钩吻（Gelsemium sempervirens Alt.）和沼泽茉莉（Gelsemium rankiniiSmall.），主要分布在北美地区；另一类是钩吻（Gelsemium elegans Benth.），主要分布在东南亚和我国的云南、贵州、福建、广东、广西、浙江、湖南等地。在民间，钩吻以外用为主，具有祛风、杀虫止痒、消肿拔毒的疗效。近年来，随着对钩吻化学成分和药理作用研究的深入，发现钩吻呈现出抗肿瘤[1-2]、消炎止痛[3]、免疫调节、抗焦虑[4]、散瞳[5]等功效，此外还具有禽畜复壮的作用。但钩吻的治疗量和中毒量相近，治疗过程中发生中毒导致呼吸停止的案例已有报道，在民间因使用不当、自杀或者恶意投毒等原因造成钩吻中毒的事件也时有发生[6]。因此，本文从钩吻的化学成分、毒理学、药物动力学和检测方法方面进行综述，以期能为法医毒物鉴定和毒理学工作者提供参考和帮助。

1 钩吻的化学成分

胡蔓藤属植物所含化学成分复杂，主要成分为吲哚类或氧化吲哚类生物碱，是其发挥药理作用和产生毒性的主要来源。到目前为止，在三种胡蔓藤属植物中共发现了120多种生物碱成分。根据化学结构不同将这些生物碱分为六大类：蛇根精（sarpagine）类、钩吻子素（koumine）类、甲基钩吻素乙（gelsedine）类、常绿钩吻碱（sempervirine）类、钩吻素甲（gelsemine）类、胡蔓藤乙素（humantenine）类，其代表化合物结构式见图1[7]。

图1 六类钩吻生物碱及其代表化合物的结构式

分布在北美地区和亚洲地区的钩吻含有的化学成分存在差异。首先，两者所含相同化学成分的含量不同，如北美钩吻中钩吻素甲含量最高，而亚洲钩吻中以钩吻素子含量最高，钩吻素甲含量次之；另一方面，两者存在不同的化学成分，如北美钩吻中分离出了21-羟基钩吻素绿碱、15-羟基胡蔓藤碱乙等钩吻生物碱。即使是相同种类的钩吻，不同产地及不同植物部位所含生物碱的种类和含量也呈现多样性，例如福建产钩吻中含有钩吻素甲、钩吻素子、钩吻素卯、钩吻素丁、钩吻素戊等，广东产钩吻中则不含钩吻素甲。闽产钩吻中各部分生物碱含量以根部含量最高，叶部含量最低[8]。

除生物碱以外，钩吻中还含有甾体和环烯醚萜等非生物碱成分，也具有一定的药理作用。有报道称，钩吻中非生物碱能够增强免疫功能，发挥一定的抗肿瘤作用[9]。

2 钩吻毒理学研究

2.1 钩吻的毒性研究

钩吻属于剧毒植物，其毒性主要来源于吲哚类或氧化吲哚类生物碱。2～3g钩吻根或7个新鲜嫩芽即可达到人的中毒致死量。刘浩等[10]总结了临床上钩吻中毒的主要症状，包括消化系统：口腔、咽喉灼痛，呕吐、腹痛、腹胀、腹泻或便秘等；神经系统：眩晕、言语含糊、吞咽困难，肌无力、呼吸肌麻痹、昏迷等；循环和呼吸系统：中毒早期呼吸快且深，心跳缓慢，继而心搏加快，呼吸慢而浅或不规则，后期体温及血压下降，呼吸困难，严重者最终因呼吸麻痹而死亡。目前临床上尚无有效解毒剂，以对症治疗为主。例如，用适量阿托品对抗迷走神经的抑制作用，用新斯的明解除肌麻痹，血液灌流和透析清除水溶性的小分子毒物等。

钩吻急性中毒的研究并不多，其急性毒性常用半数致死量（LD50）或最小致死浓度（minimal lethal concentration，MLC）来评价。钩吻提取物及主要生物碱的毒性数据总结见表1。

由表1可以看出，分布在亚洲地区的钩吻中钩吻素己毒性最大，小鼠腹腔注射LD50为0.165mg/kg[13]。含量最多的钩吻素子毒性相对较低，小鼠腹腔注射LD50为99mg/kg[13]，含量次高的的钩吻素甲经小鼠腹腔注射LD50为56.2mg/kg[13]。而北美钩吻中钩吻素乙的毒性最强，大鼠腹腔注射的MLD为0.1～0.12mg/kg[14]。

2.2 钩吻的毒性作用机制研究

目前文献中对于钩吻的研究主要集中在化学成分的结构鉴定和药理作用方面，在单体化合物水平上的活性和毒性作用机制研究报道较少，具体的作用机理仍不清楚。钩吻素甲可直接作用于胃肠平滑肌，能阻断由电刺激引起的心迷走神经的兴奋作用或阻断乙酰胆碱引发的血压反应。钩吻素子对离体小鼠脾细胞的增殖反应和体液免疫产生抑制作用。对于钩吻生物碱引起呼吸抑制的原因主要有三种解释：最早的研究认为钩吻生物碱损伤、阻断了膈神经-膈肌接头，导致外周呼吸肌麻痹；黄庆彰等[14]认为是由于脊髓中负责管辖呼吸的运动神经元被麻痹而引起呼吸衰竭和肌肉瘫痪；周跃平[15]和易金娥[16]的研究表明呼吸衰竭是因为钩吻生物碱直接抑制了呼吸中枢，后两种解释都通过各自的研究推翻了第一种说法。

表1 钩吻的毒性

3 钩吻的药物动力学研究

关于钩吻单体化合物药物动力学的研究报道比较少。张双双等[17]建立了测定大鼠血浆及组织中钩吻素甲的液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS），并用该方法研究了钩吻素甲在大鼠体内的药物动力学。该方法选择6～8周的SD雄性大鼠，以舌下静脉注射的方式给予5、2、0.5mg/kg剂量的钩吻素甲，测定不同采血时间点钩吻素甲的质量浓度，经药物和统计学软件（DAS软件，2.1版本）非房室模型拟合，得到了给药后大鼠的平均血药浓度-时间曲线（图2）。给药剂量为0.5、2mg/kg的两组，t1/2分别为（0.53± 0.12）h、（0.51±0.17）h，表明钩吻素甲在大鼠体内保留时间短。而给药剂量为5mg/kg时，t1/2为（1.0±0.11）h，说明钩吻素甲可能发生了饱和代谢。当钩吻素甲的给药剂量由0.5mg/kg增加到2mg/kg，以及由2mg/kg增加到5mg/kg时，时间曲线下面积（AUC）并没有成比例增长，表明给药剂量为5mg/kg时药物动力学呈非线性，这也同样说明钩吻素甲可能为饱和代谢或者与蛋白质结合。另外，他们还研究了钩吻在大鼠体内的组织分布。取SD雄性大鼠18只，随机分3组，舌下静脉注射2mg/kg剂量的钩吻素甲，将三组分别在给药后15、30、60min后处死并取大鼠的组织，包括心、肝、脑、肺、肾、胃、脾。经过洗涤、称重、研磨等前处理后测量各个组织中钩吻素甲的质量分数。结果表明，钩吻素甲在大鼠体内分布迅速而广泛，给药后15min在包括脑以内的各组织中达到峰值，说明钩吻素甲能穿过血脑屏障，由此也解释了它为什么有很高的神经毒性。钩吻素甲在组织中的含量由高到低为：胃、脾、肾、心、肺、脑、肝（图3）。

许盈等[18]建立了HPLC法测定生物样品中钩吻素子的含量，并研究单次灌胃给予钩吻素子后大鼠体内药代动力学及组织分布。大鼠单次灌胃15mg/kg钩吻素子，血药浓度达峰时间为（19.95±0.53）min，随即迅速下降，给药1 h后下降变缓，符合二室模型（权重为1），平均血药浓度-时间曲线见图4。钩吻素子在组织内分布广泛，胃、肠、肝、体脂、肾、脾中含量较高；分布速度快，灌胃给药5min后大部分组织达到峰浓度，但小肠和肝脏则在给药15min后浓度达到峰值，而给药60min后大部分组织中钩吻素子的含量较低，其组织分布情况见图5。

图2 大鼠舌下静脉注射3种不同浓度钩吻素甲的平均血药浓度-时间曲线

图3 大鼠舌下静脉注射2mg/kg钩吻素甲的组织分布图

图4 大鼠单次灌胃给予15mg/kg钩吻素子的平均血药浓度-时间曲线

图5 大鼠单次灌胃给予15mg/kg钩吻素子的组织分布图

4 钩吻生物碱的检测

钩吻在民间有很多俗名，易与其他中草药名混淆，且钩吻常缠绕或混杂在其他植物中，使用时可能会因误服而引起中毒。另外也有利用钩吻自杀或者谋害他人的案例，其毒性主要来源于吲哚类或氧化吲哚类生物碱。钩吻虽因品种和产地不同所含生物碱成分存在差异，但钩吻素子或（和）钩吻素甲是其主要成分，因此现有文献中所建立的分析方法多以钩吻素子或（和）钩吻素甲作为目标物。钩吻的检测分为两类：体外样品检测和生物样品检测。体外样品检测主要应用于钩吻提取物成分的分析及其定性定量分析，为钩吻药材的质量评价和安全用药提供科学依据，为钩吻中毒原因判定提供参考。生物样品检测则应用于临床监测和法医毒物学领域，由于生物样品中待测物的含量低，要求检测方法具有较高的灵敏度，为食物、药物中毒诊断提供必要的技术支持。

4.1 体外样品中钩吻生物碱的检测

体外样品中钩吻生物碱的检测方法主要有液相色谱法（LC）[8，19-20]、气相色谱-质谱联用法（GCMS）[21-27]、气相色谱-串联质谱法（GC-MS/MS）[28]等（表2）。杂质对待测目标物会有一定的干扰，因而样品前处理是影响实验结果好坏的关键步骤。根据钩吻生物碱的碱性特点，样品前处理时大多先用氢氧化钠或者氨水碱化，然后用回流法或者超声波提取，得到的提取液再用有机溶剂萃取。超声波提取与回流提取法相比，无须加热，不会对生物碱的结构造成破坏；溶剂用量少，提取时间短，效率高，优势显著。陈卫琳等[8]采用高效液相色谱法准确地测定了钩吻根茎叶中钩吻素甲、钩吻素子和胡蔓藤碱甲的含量，方法简便可靠，为钩吻的化学成分分析和中药材的质量控制提供了可靠的技术。吕芬等[27]应用GC-MS检测钩吻中毒案例体外样品中的钩吻素子和钩吻素甲，能满足应急检验迅速、准确的要求。陆亦在[28]所应用的GC-MS/MS采用二级质谱和MRM扫描，提高了检测灵敏度和专属性，为中毒样品的定性定量分析提供了必要的手段。

4.2 生物检材中钩吻生物碱的检测

目前，生物检材中钩吻生物碱的分析方法主要有LC[18]、GC-MS[29-30]、GC-MS/MS[31]、LC-MS/MS[17，32-34]。许盈等[18]建立了HPLC-紫外检测法测定大鼠血液和组织中钩吻素子的含量，用乙酸乙酯萃取法进行前处理，线性范围分别为0.06～10.00μg/mL、0.08～5.00μg/g，并将该方法用于研究灌胃给予钩吻素子后大鼠体内的药物动力学及组织分布。马克芹等[29]建立了测定人血中钩吻素甲含量的GC-MS，前处理采用乙醚萃取，方法检测限为0.03μg/mL，在0.5～400μg/mL范围内线性良好。与前几种方法相比，LC-MS/MS法将液相色谱的分离能力和质谱提供化合物结构信息的功能结合在一起，具有选择性强、灵敏度高的优势。张双双等[17]采用乙腈沉淀蛋白法处理血浆和组织，建立了测定大鼠血浆和组织中钩吻素甲的HPLC-MS/MS，并研究了大鼠静脉注射钩吻素甲后的药物动力学和组织分布。线性范围为1～500ng/mL，定量限可低至1 ng/mL。陈建忠等[34]为检测大鼠血浆中的钩吻素子建立了快速而灵敏的UPLC-MS/MS，前处理采用甲醇沉淀蛋白法，最低定量限为0.025μg/mL，为钩吻素子的药物动力学研究提供了有效的分析方法。

5 展望

现有文献中有很多关于钩吻化学成分、药理作用以及临床应用方面的报道，但钩吻化学成分复杂且单体含量低，导致药理作用和临床应用方面的研究主要停留在钩吻总碱的水平上，单体化合物的活性研究比较少；钩吻的活性研究多在体外进行，体内的作用情况还需进一步验证；治疗剂量和毒性剂量接近，有必要找到合适的剂量或者高效而低毒的化学成分发挥其药理作用。

在毒性和毒理方面，钩吻总碱、主要成分钩吻素甲和钩吻素子以及毒性较大的一些生物碱的毒性研究已有报道，但引起人和动物中毒的机理并不清楚。中毒剂量下钩吻有毒成分吸收、代谢、排泄方面的研究缺乏，因此建立合适的动物模型和检测方法，研究钩吻有毒成分在动物体内的毒物动力学和组织分布，对法医毒物鉴定中钩吻中毒案件的取材和检测结果的评价具有重要的指导意义。

表2 钩吻的样品前处理与检测方法

参考文献：

[1]黄静，苏燕评，俞昌喜，等.钩吻生物碱化合物体外抗消化系统肿瘤的活性[J].海峡药学，2010，（3）：197-200.

[2]杨克政，黄菊，吴英德，等.钩吻治疗原发性肝癌存活两年以上8例报告[J].广西医学院学报，1981，（3）：66-68.

[3]Liu M，Shen J，Liu H，et al.Gelsenicine from Gelsemium Elegans Attenuates Neuropathic and Inflammatory Pain in Mice[J].Biol Pharm Bull，2011，34（12）：1877-1880.

[4]周名璐，黄聪，杨小平.钩吻总碱的镇痛、镇静及安全性研究[J].中成药，1998，（1）：2.

[5]王友顺，高英立，刘上云，等.盐酸钩吻碱眼药水散瞳与调节麻痹作用的临床观察[J].中药药理与临床，1990，（6）：40-42.

[6]广西壮族自治区浦北县人民医院内科.中西医结合抢救钩吻中毒三例[J].新医学，1972，（9）：32-33.

[7]Jin G L，Su Y P，Liu M，et al.Medicinal Plants of the Genus Gelsemium（Gelsemiaceae，Gentianales）—a Review of theirPhytochemistry，Pharmacology，Toxicology and Traditional use[J].JEthnopharmacol，2014，152（1）：33-52.

[8]陈卫琳，杨樱，吴水生.闽产钩吻根茎叶中钩吻碱甲和钩吻素子及葫蔓藤碱甲的含量测定[J].福建中医药大学学报，2011，（5）：48-50.

[9]赵明宏，郭涛，王敏伟，等.钩吻中非生物碱不同组分体内、外抗肿瘤作用比较研究[J].中国药房，2006，（23）：1776-1778.

[10]刘浩，俞昌喜.钩吻的研究进展[J].福建医科大学学报，2008，（5）：469-472.

[11]谭建权，邱成之，郑林忠.钩吻碱的镇痛作用和无依赖性[J].中药药理与临床，1988，（1）：24-28.

[12]Rujjanawate C，Kanjanapothi D，Panthong A.Pharmacological Effect and Toxicity of Alkaloids from Gelsemium Elegans Benth[J].JEthnopharmacol，2003，89（1）：91-95.

[13]陈翼胜.中国有毒植物[M].北京：科学出版社，1987：371-376.

[14]黄庆彰，黄明.胡蔓藤属植物、成分及毒理作用[J].广西卫生，1980，（3）：32-35.

[15]周跃平，徐伟，陈先瑜.胡蔓藤碱甲的毒性及呼吸抑制作用[J].中国药理学与毒理学杂志，1995，（1）：69-72.

[16]易金娥.钩吻的毒性作用机理与毒性病理学研究[D].湖南：湖南农业大学，2002.

[17]Zhang S，Hu S，Yang X，et al.Development of a Liquid Chromatography with Mass Spectrometry Method for the Determination of Gelsemine in Rat Plasma and Tissue：Application to a Pharmacokinetic and Tissue Distribution study[J].JSep Sci，2015，38（6）：936-942.

[18]许盈，郑宓，李苏平，等.钩吻素子在大鼠体内的药物代谢动力学及组织分布[J].福建医科大学学报，2013，（4）：199-203.

[19]罗淑荣，李彤，杨峻山.RP-HPLC法测定钩吻生物碱[J].药学学报，1993，（9）：695-698.

[20]栗建明，冯时茵，何华红，等.单一内标多控法同步测定钩吻中钩吻碱甲和钩吻素子的含量[J].中药材，2013，（10）：1626-1631.

[21]杨玉林，温忆敏，芮振荣，等.气相色谱-质谱联用技术分析中毒样品中四种生物碱[J].中国卫生检验杂志，2004，（3）：272-273.

[22]张兰兰，黄昌全，张忠义，等.GC-MS对钩吻提取物成分的分析研究[J].中药材，2005，（9）：779-781.

[23]黄伟雄，李汴生，梁春穗，等.GC/MS测定断肠草中钩吻碱方法研究[J].中国食品卫生杂志，2008，（2）：136-138.

[24]谢明清，丁操.GC/MS检验胃内容中的钩吻毒素[J].广东公安科技，2011，（4）：13-15.

[25]张瑞，雷宁生，林莹，等.气相色谱-质谱联用法检测中毒酒样中的钩吻碱[J].广西科学，2012，（3）：239-240.

[26]郭萍，陈建安，杜恣闲，等.一起“钩吻碱”引起的中毒事件GC-MS-AMDIS快速分析[J].中国卫生检验杂志，2012，（10）：2519-2525.

[27]吕芬，余胜兵，黄伟雄，等.气质联用法在应急检测疑似断肠草中毒中的应用[J].食品安全质量检测学报，2013，（3）：677-681.

[28]陆亦在.断肠草中毒的GC-MS-MS检测方法[J].医学检验与临床，2013，24（2）：84-86.

[29]马克芹，王毅.GC/MS法测定人血中钩吻碱甲[J].微量元素与健康研究，2014，31（6）：48-50.

[30]张春水，郑珲，何毅，等.钩吻素甲的气相色谱-质谱分析[J].质谱学报，2004，（3）：172-174.

[31]吴惠勤，张春华，黄晓兰，等.气相色谱-串联质谱法同时检测尿液中15种有毒生物碱[J].分析测试学报，2013，（9）：1031-1037.

[32]张春华，吴惠勤，黄晓兰，等.液相色谱-电喷雾串联质谱同时检测尿液和胃液中12种有毒生物碱[J].分析化学，2012，（6）：862-869.

[33]熊小婷，吴惠勤，黄晓兰.液相色谱-电喷雾串联质谱同时检测血液中8种有毒生物碱[J].分析化学，2009，（10）：1433-1438.

[34]Chen JZ，Li Y，Xiao JP，et al.Development of a Sensitive and Rapid UPLC-MS/MSMethod for the Determination of Koumine in Rat Plasma：Application to a Pharmacokinetic Study[J].Biomed Chromatogr，2013，27（6）：736-740.

（本文编辑：严 慧）

Advances in the Study of Toxicology and Determ ination of Gelsem ium Elegans

JISheng-jie1,2,LIUWei1
(1.Shanghai Key Laboratory of Forensic Medicine,Shanghai Forensic Service Platform,Institute of Forensic Science, Ministry of Justice,Shanghai200063,China;2.Departmentof Forensic Medicine,School of Basic Medical Sciences,Fudan University,Shanghai200032,China)

Gelsemium elegans is a herbaceous plant in the loganiaceae family and is extremely toxic.It contains complex chemical substances and has rich indole alkaloids or oxindole alkaloids,which are the main source of pharmacological effects and high toxicity.In addition,the therapeutic dose of gelsemium elegans is close to its toxic dose.Cases of Gelsemium elegans poisoning because ofmisuse,suicide and poisoning have been reported now and then.It is harmful to human digestive system,nervous system,circulatory system and respiratory system.The person who is severely poisoned will die from respiratory paralysis eventually.According to researches at home and abroad,this paper reviewed the studies of Gelsemium elegans’s chemical composition,toxicology,pharma-cokinetics and analyzing methods,providing reference for the forensic identification and clinical diagnosis and treatmentof Gelsemium elegans poisoning.

Gelsemium elegans;alkaloid;poisoning;determination

DF795.1

A

10.3969/j.issn.1671-2072.2017.03.004

1671-2072-（2017）03-0024-07

2016-12-12

上海市法医学重点实验室资助项目（17DZ2273200）；上海市司法鉴定专业技术服务平台资助项目（16DZ2290900）作者简介：姬圣洁（1991—），女，硕士研究生，主要从事法医毒物化学研究。E-mail：JSJ1990jsj@126.com。

刘伟（1963—），女，主任法医师，硕士研究生导师，主要从事法医毒物学研究。E-mail：liuw@ssfjd.cn。