RhD阴性患者输注DEL型血液的安全性研究*

王敏 王保龙 周明 完晓菊 廖艳秋

·论著·

RhD阴性患者输注DEL型血液的安全性研究*

王敏 王保龙 周明 完晓菊 廖艳秋

目的 探讨RhD阴性患者输注DEL型血液的安全性。方法 采用间接抗人球蛋白法及热吸收放散方法对RhD阴性献血者血液进行DEL型检测，并采用DNA测序方法分析DEL型献血者的RHD基因序列，回顾性分析接受DEL型血液RhD阴性患者体内抗-D产生情况。结果 经吸收放散方法确认的13例DEL阳性的献血者均携带RHD1227A等位基因，12例接受DEL型血液的RhD阴性患者体内抗-D水平均无变化，1例患者体内抗-D水平由8升高到32。结论 DEL型血液引起抗-D同种免疫反应的可能性较低，但DEL型血液仍具有一定的免疫原性，对于体内已存在抗-D抗体的患者应避免输注DEL型血液。

DEL 抗-D RHD1227A等位基因 Rh血型

Rh血型系统抗原种类较多，其中D抗原免疫原性最强，具有重要的临床意义。根据D抗原的有无将Rh血型分为RhD阳性及RhD阴性。DEL型是弱D的一种，其红细胞膜表面D抗原表位数目较少，仅能通过敏感的吸收放散方法检测出来，称为D放散型。DEL型在高加索人种较少见，在我国RhD阴性人群中高达26%，绝大部分表现为RHD1227 G＞A碱基突变[1]。关于RhD阴性患者接受DEL型血液输注的安全性一直备受临床输血界的关注，通过调查本院RhD阴性患者接受DEL型血液后体内抗-D同种免疫反应的产生情况，进一步分析RhD阴性患者接受DEL型血液输注的安全性，现报道如下。

材料与方法

1 材料

1.1 标本来源：收集本院2015年9月～2017年1月微柱玻璃珠卡式法初筛为RhD阴性的41例接受输血的住院患者，经间接抗球蛋白试验（IAT）鉴定为RhD阴性，男性8例，女性33例，年龄2月~71岁。对41例RhD阴性患者所输注的65例献血者血液通过吸收放散试验进行DEL型检测，最终确认为DEL者17例。

1.2 试剂：血型鉴定及意外抗体筛选用微柱玻璃珠卡 （Ortho-Clinical Diagnostic）；Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ号O型抗体筛选用红细胞、抗体鉴定用谱细胞、多特异性抗人球蛋白抗体、标准试剂红细胞及抗-C、抗-c、抗-E、抗-e 血清（上海血液生物医药有限责任公司）；3种不同批号的IgG、IgM混合单克隆抗-D（美国IMMUCOR公司）；QIAamp DNA提取试剂盒（德国Qiagen公司）；RHD 1-10个外显子引物（上海生工生物有限公司合成）；Mark 50bp DNA Ladder（美国life公司）；DNA溶解液（上海生工生物有限公司合成）；DNA染料（北京赛百盛公司）；Taq酶（上海 Promega公司）；琼脂糖（法国 Biowest公司）；DNA Isolation Kit 提取试剂盒（北京PEL-FREEZ公司）。

1.3 仪器：AutoVue Innova全自动血型分析仪（美国强生）；2005-2型血型血清学专用离心机（台湾BASO）；TDZ4A-WS型水平离心机（湖南湘仪）；PCR扩增仪（美国ABI公司）；DNA测序仪（美国ABI PRISM 3730全自动测序仪）。

2 方法

2.1 吸收放散方法鉴定DEL型：将间接抗人球蛋白法检测为RhD阴性的献血者红细胞用生理盐水洗涤3遍后，制成压积红细胞，加入等量的3种不同批号的IgG、IgM混合单克隆抗-D血清，混匀后置37℃水浴箱孵育1 h，采用大口径试管用生理盐水将孵育后的压积红细胞洗涤6遍，留取最后1次上清作为平行对照并经IAT抗-D检测为阴性；再加入等量的生理盐水于压积红细胞中充分混匀，置56℃水浴箱中放散8~10 min，3 000 r/min，离心5 min，吸取200μl放散液并加入O型标准试剂红细胞2滴，混匀后37℃水浴30 min，用生理盐水洗涤3遍后，加入100μl多特异性抗人球蛋白试剂，1 000 r/min，离心1 min，显微镜下观察结果。

2.2 采用传统的试管法检测患者RhCE表型：参照文献[2]。

2.3 RHD基因测序分析：参照李勤等[3]报道的方法，采用Sequencing scanner 1. 0 软件进行分析。2.4 抗-D效价测定：采用传统的抗人球蛋白试管法动态监测RhD阴性患者输注DEL型血液前及输注后1周～12个月体内抗-D水平的变化。抽取输注DEL型血液的RhD阴性患者外周血5 ml于枸橼酸钠抗凝管中，充分混匀后离心分离血清，采用微柱玻璃珠卡式法对待测样本进行意外抗体筛选，对结果为阳性的样本进行意外抗体鉴定；对意外抗体鉴定为抗-D的样本采用经典的抗人球蛋白试管法进行效价测定，倍比稀释待测血清后，每管加入O型标准试剂红细胞1滴，置37℃水浴箱孵育30 min，生理盐水洗涤3遍，再加入100μl多特异性抗人球蛋白试剂，1 000 r/min，离心1 min，显微镜下观察结果。

结果

1 DEL表型的血清学及基因型检测 通过间接抗人球蛋白法及吸收放散法确认后，共有13例RhD真阴性患者输注了DEL型血液，DEL型献血者共17例，占总数的26.12%。DNA测序结果采用Sequencing scanner 1. 0 软件分析。将得到的DNA测序结果与GenBank中的RHD基因序列比对，结果显示17例DEL型献血者均携带RHD1227A等位基因，结果见图1。

2 RhD阴性患者输注DEL型血液体内抗-D水平的变化 经追踪随访13例输注DEL型血液的RhD阴性患者（男性4例，女性9例），有孕产史的6例，4例为反复输血。动态监测13例RhD阴性患者输注DEL型血液前及输注后1 周～6 个月期间体内抗-D水平变化，结果显示12例患者体内抗-D水平无任何变化，1例患者体内抗-D效价由8升至32，结果见表1。

图1 DEL表型RHD基因序列第9外显子处存在碱基突变1227G→A

表1 13例RhD阴性患者输注DEL型血液后体内抗-D水平变化

讨 论

Rh血型系统具有丰富的遗传多态性，种族不同，RHD分子遗传背景也存在一定的差异，且存在多种D变异体。D抗原变异型主要包括弱D及部分D，主要由RHD基因、重组、点突变、mRNA的表达降低等原因导致[4-6]。DEL型在20世纪80年代由日本学者Okubo发现，是一种极弱的D抗原，采用常规鉴定方法无法检测出DEL型，只有通过敏感的吸收放散实验才能被检出[7]。与高加索人种相比，DEL型在亚洲人群中呈现高表达，约占总RhD阴性人群的1/3，我国各地区报道的DEL型比率不同，Shao等[8]报道广东深圳地区DEL型占初筛RhD阴性人群的26%。本课题组报道安徽地区DEL型占初筛RhD阴性人群的比率为22%[9]。采用DNA测序检测DEL型献血者RHD基因序列，结果显示17例DEL型献血者均携带RHD1227A等位基因。亚洲人群中DEL型个体多数携带完整的RHD基因，国际基因组织最先收录的DEL型等位基因为RHD1227A等位基因，是由单个核苷酸突变引起的，其等位基因第1 227处碱基G突变为A[8，10-12]。 DEL型个体红细胞D抗原位点数目远远低于正常Rh 阳性个体红细胞位点数目。朱美玲等[13]报道DEL型红细胞膜表面D抗原的分子数约为22个。本课题组早在2011年研究发现DEL型个体基本拥有完整的D抗原表位，同时DEL红细胞膜表面D抗原强度极低，远远小于正常RhD阳性红细胞，略高于真实RhD阴性红细胞。

国外有文献报道[14，15]RhD 真实阴性受血者输用DEL型血液后体内抗-D 效价升高或抗-D抗体从无到有。我国学者冯双利于2001年报道1例RhD阴性患者输注DEL型血液后体内产生抗-D抗体[16]，王宝燕等报道2例输注DEL型血液的Rh阴性患者，抗-D 效价升高[17]。 目前我国通过间接抗人球蛋白法对RhD阴性献血者进行弱D筛查，但并未进行DEL型检测，临床输血中DEL型血液一直以此作为RhD阴性血液应用于临床输血。基本完整的D抗原表位表达及携带完整的RHD基因表明DEL型血液仍具有一定的免疫原性，存在导致输血不良反应的风险。

本次研究采用传统的抗人球蛋白试管法，动态监测RhD阴性患者输注DEL型血液前及输注后1周～12个月体内抗-D水平的变化，从而评价DEL型血液输注给RhD真阴性患者的安全性，同时采用DNA测序检测DEL型献血者的RHD基因序列，结果显示17例DEL型献血者均携带RHD1227A等位基因；12例RhD阴性患者体内抗-D水平无任何变化，效价均是0，1例RhD阴性患者体内抗-D效价由8升至32，结果提示，DEL型血液具有一定的免疫原性。由于DEL型个体红细胞膜表面表达的D抗原数目较少，不足以引起初次抗-D免疫应答，因此，DEL型血液对于患者输注前体内未产生抗-D的RhD阴性患者来说应该是安全的，但对于患者输注前体内已存在抗-D抗体的患者应避免输注DEL型血液，因为RhD阴性个体首次输血或妊娠时机体会被RhD阳性血液致敏，当该个体再次受到D抗原刺激时，只需极少量的D抗原阳性的红细胞即可激发B细胞回忆反应，导致大量的抗-D产生。对于DEL型血液输注的安全性分析尚需扩大样本量，深入探讨不同DEL基因型个体的免疫原性，制定出更加完善的RhD阴性患者血液输注原则，规范RhD阴性患者血液输注流程，确保临床输血安全。

1 Shao CP，Maas JH，Su YQ，et al. Molecular background of Rh D-positive，D-negative，Del and weak D phenotypes in Chinese[J]. Vox Sang，2002，83（8）：156-161.

2 李勇，马学严.实用血液免疫学［M］.北京：科学出版社，2006.

3 李勤，叶璐夷，郭忠慧，等.中国人群中 Del 表型分子背景研究[J].中华医学遗传学杂志，2006，23（5）：486-491.

4 Chen DP，Sun CF，Nin HC，et al. Comprehensive analysis of RHD splicing transcripts reveals the molecular basis for the weak anti-D reactivity of Delred blood Cells[J]. Transfusion Medicine，2016，26（2）：123–129.

5 Rubina Nazli，Jamila Haider，Mohammad Akmal Khan，Tasleem Akhtar &Hina Aslam.Frequency of ABO blood groups and RhD factor inthe female population of DistrictPeshawar[J]. Pak J Med Sci，2015，31（4）：984-986.

6 Silva-Malta MCF，Fidélis Araujo NC，O. V. Neves Vieira，L. Cayres Schmidt，P. de Cassia Goncalves & M. LobatoMartins Dried blood spots of pooled samples for RHD gene screening in blood donors of mixed ancestry[J]. Transfusion Medicine，2015，25（5）：337–341.

7 Okubo Y，Yamaguchi H，Tomita T，et al. A D variant，Del ? [J]. Transfusion，1984，24（6）：542.

8 Shao CP，Maas JH，Su YQ，et al. Molecular background of Rh D-positive，D-negative，DEL and weak D phenotypes in Chinese[J]. Vox Sang，2002，83（2）：156-161.

9 王敏，王保龙，蒋光明，等. Del红细胞膜表面D抗原表位及抗原强度分析[J]. 中国输血杂志，2011，24（1）： 23-26.

10 朱自严.RhD抗原的鉴定 我们该做的多深入[J].临床输血与检验，2016，18（4）：305-311.

11 Seo MH，Won EJ，Hong YJ，et al. An effective diagnostic strategy for accurate detection of RhD variants including Asian DEL type in apparently RhD-negative blood donors in Korea[J]. Vox Sang，2016，111（4）：425-430.

12Wang M，Wang BL，Xu W，et al. Anti-D alloimmunisation in pregnant women with DEL phenotype in China[J].Transfus Med，2015，25（3）：163-169.

13 朱美玲，周丹，谢亚琴，等. Del红细胞膜D抗原分子定量分析[J]. 中国输血杂志，2008，21（7）：512-513.

14 Wagner T，Kormoczi GF，Buchta C，et al. Anti-D immunization by Del red blood cells[J]. Transfusion，2005，45（4）：520-526.

15 Yasuda H，OhtoH，Sakuma S，et al. Secondary anti-D immunization by Del red Blood cells[J]. Transfusion，2005，45（4）：1581-1584.

16 冯双利，卢志芬，刘则红.133名RhD（–）无关献血者中Del的检测分析[J]. 中国输血杂志，2001，14（5）：3071.

17 王宝燕，张建耕，徐华，等. Rh 阴性个体输入 Del 红细胞产生抗-D 免疫的研究[J]. 中国输血杂志，2011，24（7）：592-594.

The Safety of DEL Red Blood Transfusion in RhD-negative Recipients

WANG Min，WANG Bao-Long，ZHOU Ming，et al.
Department of Blood Transfusion，Affiliated Provincial Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230001

Objective To explore the security of DEL red blood cells transfusion to Rh negative recipient. Methods IAT and adsorption-elution were performed on the investigated blood samples to test RhD-negative recipients and DEL phenotype. RHD genotyping were performed with gene sequencing for DEL phenotypes，anti-D alloimmunization was investigated in RhD-negative recipients transfused with DEL red blood cells. Results All the DEL donors were confirmed to carry RHD RHD1227A allele. The titer and strength of anti-D antibodies of 12 true D-negative recipients who were transfused with DEL blood showed no significant difference. However，the titer of anti-D antibodies of one true D-negative recipient increased from 8 to 32.Conclusions Alloanti-D immune response induced by DEL is a rare event in true D-negative recipients. But DEL donors should be excluded for transfusion to D-negative recipients who had carried anti-D.

DEL Anti-D RHD1227A allel Rh blood group

R457.1+1 R392.13

A

1671-2587（2017）03-0230-04

201-01-05）

（本文编辑：王敏）

10.3969/j.issn.1671-2587.2017.03.006

*本课题受国家自然科学基金（No.30972815）资助

230001 安徽医科大学附属省立医院输血科

王敏（1982–），女，安徽宿州人，主管技师，硕士，主要从事输血医学工作，（E-mail）1085054623@qq.com。通信作者：王保龙，男，主任技师，教授，博士生导师，主要从事血液免疫学研究，（E-mail）wbl1965@sohu.com。