动脉不同剪切力实验动物模型的建立

董丽萍，黄达，甘廖英，刘光敏，王加杰，蔡维君*

（1中南大学基础医学院组织学与胚胎学系，长沙 410013；2长沙医学院人体解剖与组织胚胎学教研室，长沙医学院神经科学中心，长沙 410219）

动脉不同剪切力实验动物模型的建立

董丽萍1,2，黄达1，甘廖英1，刘光敏1，王加杰1，蔡维君1*

（1中南大学基础医学院组织学与胚胎学系，长沙 410013；2长沙医学院人体解剖与组织胚胎学教研室，长沙医学院神经科学中心，长沙 410219）

目的寻找一种简单、准确的方法建立动脉的不同剪切力动物模型，为研究剪切力在心血管系统中的作用及机制奠定基础。方法30只SD大鼠随机分为3组，即颈总动脉结扎组、股动静脉吻合组和髂总动脉结扎组，每组又分为手术组和假手术组（对照组），利用多普勒超声仪检测手术前后动脉血流，估算血流剪切力的变化。利用免疫荧光组织化学法检测不同剪切力下血管内皮eNOS的表达情况。结果颈总动脉结扎法大鼠死亡率高；股动静脉吻合法手术耗时长，且因动脉太小不易测得股动脉血流；单侧髂总动脉结扎手术可以使双侧髂总动脉分别形成不同血流剪切力。单侧髂总动脉结扎术后，结扎侧髂总动脉内皮eNOS免疫反应性减弱，而结扎对侧eNOS免疫反应性增强。结论单侧髂总动脉结扎手术简单易操作，髂总动脉血流速度通过多普勒超声仪可获得，是制作不同剪切力动物模型的最佳方法。

剪切力；动物模型；结扎；吻合

血液流动过程产生的剪切力在血管稳态的维持、动脉粥样硬化的发生等方面发挥着重要作用[1]。对于剪切力在心血管系统的作用及机制的研究大多都是在体外应用流体剪切力培养系统给予培养的细胞不同剪切力进行[2,3]。虽然体外研究可以单独研究某一因素的作用，而体内微环境复杂，体外研究并不能代替体内研究，也不能说明生理条件下某一因素的作用。本研究力图寻找一种简单、准确的方法建立动脉的不同剪切力动物模型，为在体研究剪切力在心血管系统中的作用及机制奠定基础。

材料与方法

1 颈总动脉结扎法

12只3月龄SD大鼠（250～300g）分为假手术组和结扎组，结扎组大鼠行单侧颈总动脉结扎手术。腹腔注射10%水合氯醛（0.35ml/100g）麻醉大鼠，去除颈部毛发，沿大鼠颈部中线剪开皮肤，钝性分离肌肉，找到颈总动脉及其伴行静脉，分离一侧颈总动脉并用5-0手术缝合线结扎（图1），伤口处给予抗生素，3-0手术缝合线缝合皮肤。

2 股动静脉吻合法

图2 大鼠股动静脉吻合法示意图。A，股动静脉吻合模式图；B，股动静脉吻合实物图Fig. 2 Rat FAVA. A, schematic diagram; B, operation picture

图3 大鼠髂总动脉结扎法示意图。A，髂总动脉结扎模式图；B，髂总动脉结扎实物图Fig. 3 Rat CIAL. A, schematic diagram; B, operation picture

6只3月龄SD大鼠（250～300g），对其左侧行股动静脉吻合手术，右侧行假手术作为对照。腹腔注射10%水合氯醛（0.35ml/100g）麻醉大鼠，去除腹股沟部位毛发，沿大鼠腹股沟切开皮肤，找到股动静脉并分离，体视显微镜下在股动静脉上各剪开一小口，然后用10-0手术缝合线吻合动静脉（图2）。伤口处给予抗生素，3-0手术缝合线缝合皮肤。

3 髂总动脉结扎法

12只3月龄SD大鼠（250～300g）分为假手术组和结扎组，结扎组大鼠行单侧髂总动脉结扎手术。腹腔注射10%水合氯醛（0.35ml/100g）麻醉大鼠，去除腹部毛发，沿大鼠下腹部中线切开皮肤和肌肉，找到腹主动脉和髂总动脉，分离一侧髂总动脉并用5-0手术缝合线结扎（图3）。伤口处给予抗生素，3-0手术缝合线分别缝合肌肉和皮肤。

所有动物在术前、术后利用频谱多普勒仪测量血流、血管直径等数据，根据公式计算并比较髂总动脉剪切力大小。

4 免疫荧光染色

在髂总动脉结扎术后7d，取双侧髂总动脉，入4%多聚甲醛固定，30%蔗糖沉糖，冰冻切片（片厚10μm），应用免疫荧光染色检测内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase ，eNOS）的表达。一抗：eNOS (1∶100)，生物素化二抗（1∶200），荧光标记的链酶亲和素（1∶1000），用DAPI（2μg/ml）染核。荧光显微镜（Leica，AF6000）观察并拍照。

5 数据处理

用Image Pro Plus 6.0 (IPP)分析免疫荧光染色结果图片，测量每张照片的累积光密度和面积，计算出平均光密度。所有数据以s表示，采用SPSS统计软件进行完全随机设计的方差分析，以P＜0.05为具有统计学显著性意义。

结 果

1 颈总动脉结扎组大鼠死亡率高

9只SD大鼠颈总动脉结扎术后，次日死亡3只，另外的6只也陆续死亡。死亡率高达100%。

2 股动静脉吻合组大鼠血流速度不易测得

股动静脉吻合术后，大鼠存活率100%，但是在手术过程中血管夹对血管造成损伤，而且用频谱多普勒仪测量血流速度时，因血管管径小测不到而无法计算切应力的大小。

3 髂总动脉结扎组大鼠结扎侧髂总动脉血流速度降低而结扎对侧血流速度加快

髂总动脉结扎术后，大鼠存活率100%，频谱多普勒结果显示，与假手术组血流速度（48.6±2.441）相比，结扎组大鼠结扎对侧髂总动脉血流速度加快（78.00±2.236），结扎侧血流微弱（6.44±0.25）（图4）。血流剪切力τ可通过如下公式计算：τ＝4μQ/πr3[6]，由此可见，剪切力大小取决于血液粘度（μ）、血流量（Q）及血管内径（r），而血流量（Q）的大小取决于血流速度和血管横截面积。故剪切力与血流速度成正比，血流速度越快，剪切力越大，血流速度越慢，剪切力越小。单侧髂总动脉结扎组大鼠在手术前后，血液粘度和血管内径不变，结扎对侧髂总动脉血流速度加快，故剪切力增大，结扎侧血流速度减慢，故剪切力减小。

4 切应力与髂总动脉内皮eNOS免疫反应性呈正相关

对髂总动脉内皮eNOS水平进行免疫荧光染色检测显示，与正常对照组相比，结扎后7d结扎对侧髂总动脉内皮eNOS免疫反应性增强上调，而结扎侧髂总动脉内皮eNOS免疫反应性降低且呈点状分布(图5)。

讨 论

血流切应力是血流与管壁摩擦产生的平行于管壁的切应力，在调节着血管内皮细胞的基因表达和功能等方面发挥重要的作用。以往的研究发现，动脉弯曲处和分支处的切应力低且是湍流，是动脉粥样硬化斑块的易发部位，而动脉的直行部位切应力高且是层流，不容易形成斑块[4,5]。对于剪切力在心血管系统的作用及机制的研究大多都是在体外应用流体剪切力培养系统给予培养的细胞不同剪切力进行[2,3]。本研究力图寻找一种简单、准确的方法建立动脉不同剪切力动物模型，为在体研究剪切力在心血管系统中的作用及机制奠定基础。

图4 髂总动脉结扎对血流速度的影响。A，假手术组髂总动脉血流速度；B，单侧髂总动脉结扎对侧髂总动脉血流速度加快；C，单侧髂总动脉结扎侧髂总动脉血流速度降低；D，各组血流速度的比较，*，与假手术组相比，P＜0.01Fig. 4 The efect of CIAL on blood fow velocity. A, the blood fow velocity in the common iliac artery of the sham operation group; B, after unilateral CIAL, the blood fow velocity in the contralateral common iliac artery increased; C, after unilateral CIAL, the blood velocity in the ligated artery decreased; D, comparison of the blood fow velocity in the common iliac artery among the three groups; *, P＜0.01, compared with the sham group

图5 髂总动脉结扎对髂总动脉内皮内eNOS免疫反应性的影响。A，正常对照组髂总动脉；B，结扎后7d对侧髂总动脉；C，结扎后7d同侧髂总动脉；蓝色：细胞核；红色，eNOS免疫反应性；D，髂总动脉结扎对髂总动脉内皮内eNOS免疫反应性影响的统计学分析比较； *，与正常对照组相比，P＜0.01；比例尺，200μmFig. 5 The efect of CIAL on the expression of eNOS in common iliac arterial epithelium. A, eNOS expression in the control group; B, eNOS expression in the contralateral iliac artery 7d after ligation; C, eNOS expression in the ligated common iliac artery 7d after ligation; D, statistical analysis of eNOS immunoreactivity in the three groups; blue, cell nucleus; red, positive expression of eNOS; *, P＜0.01, compared with the control group; scale bar, 200μm

颈总动脉结扎法动物存活率低，不利于用于制作不同剪切力动物模型。股动静脉吻合法对操作者要求高，耗时较长，一般需要3h以上，手术过程中血管夹易损伤血管管壁，且近吻合处易形成小血栓从而影响血流，再加上因血管管径小不易测得血管内血流速度等数值，此方法也不是理想的制作不同剪切力动物模型的方法。相比这两种方法，髂总动脉结扎法操作简单，动物存活率高。另外，髂总动脉管径较大，动脉内血流速度等数据可用多普勒仪检测，可准确计算血流剪切力。髂总动脉结扎组大鼠髂总动脉血流剪切力τ可通过如下公式计算：τ＝4μQ/πr3[6]，由此可见，剪切力大小取决于血液粘度（μ）、血流量（Q）及血管内径（r），而血流量（Q）的大小取决于血流速度和血管横截面积。故剪切力与血流速度成正比，血流速度越快，剪切力越大，血流速度越慢，剪切力越小。单侧髂总动脉结扎组大鼠在手术前后，血液粘度和血管内径不变，结扎对侧髂总动脉血流速度加快，故剪切力增大，结扎侧血流速度减慢，故剪切力减小。

心血管疾病的发生与内皮细胞功能障碍相关。而内皮细胞功能障碍在很大程度上是由于血管舒张剂一氧化氮（Nitric oxide, NO）的产生和生物利用率降低，导致动脉舒张功能受损。NO是由内皮细胞产生的一种关键血管舒张剂。生理学上，NO调节血管舒张、抑制血管炎症、血栓形成和异常的细胞增殖[7]。血管NO生物利用率的整体下降主要是由eNOS活性显著下降，它可被血流剪切力激活[8]。本研究中免疫荧光组织化学染色结果显示，高剪切力作用下，血管内皮eNOS表达上调，低剪切力作用下，血管内皮eNOS表达下降，与以往的研究结果一致[9]。

由此可见，通过单侧髂总动脉结扎可获得不同剪切力动物模型，是制作不同剪切力实验动物模型比较理想的方法。

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Establishment of experimental animal models of different shear stress

Dong Liping1,2, Huang Da1, Gan Liaoying1, Liu Guangmin1, Wang Jiajie1, Cai Weijun1*
（1Department of Histology and Embryology, School of Basic Medicine, Central South University, Changsha 410013, China;2Department of Anatomy, Histology and Embryology, Institute of Neuroscience, Changsha Medical University, Changsha 410219, China）

ObjectiveTo explore a simple and easy method of establishing animal models of diferent shear stress in the arteries for purpose of studying the role of shear stress in the cardiovascular system and its mechanism.Methods30 SD rats were randomly divided into three groups, the common carotid artery ligation (CCAL) group, femoral artery-vein anastomosis (FAVA) group and common iliac artery ligation (CIAL) group. Each group was further divided into an operation group and a sham operation group (control group). The arterial blood fow was detected before and after operation by Doppler ultrasound, and the change in blood fow shear stress estimated. The expression of eNOS in vascular endothelium under diferent shear stress was detected by immunofuorescence histochemistry.ResultsThe mortality rate was high in CCAL group. FAVA was time-consuming, and the blood fow was not easy to measure in the narrow femoral artery. Unilateral CIAL generated diferent blood fow shear stress in bilateral common iliac arteries, after which the immunoreactivity of eNOS in the endothelium of the ligated common iliac artery decreased while that of the contralateral iliac artery increased.ConclusionUnilateral CIAL is simple and easy to perform. The blood fow velocity in the common iliac artery is measurable by Doppler ultrasound. Therefore unilateral CIAL is the optimum method of establishing animal models of diferent shear stress.

Shear stress; animal model; ligation; anastomosis

R329

A

10.16705/ j. cnki. 1004-1850. 2017.02.014

2016-12-04

2017-03-25

湖南省卫生厅医药卫生科研计划项目（C2016052）；湖南省教育厅科学研究一般项目（16C0163）

董丽萍，女（1984年），汉族，讲师

*通讯作者(To whom correspondence should be addressed)：wjcai@yahoo.com