微生物发酵法制备铁皮石斛多糖及抗氧化活性的研究

安全++许丹妮++李光敏++王连春++李萌++苏宁++王昌涛

摘要：采用微生物发酵法提取铁皮石斛中的多糖，探讨料液比和pH对多糖提取率的影响，并评价多糖的体外抗氧化活性。2因素3水平正交法优化的铁皮石斛多糖提取，料液比为1∶90（g/mL），pH为5，在此条件下的多糖提取率为42.86%；探究微生物发酵铁皮石斛多糖对羟自由基和DPPH自由基的清除作用，结果显示，微生物发酵法制备的铁皮石斛粗多糖具有一定的抗氧化性，且自由基清除率在一定范围内随浓度增加而增强。

关键词：铁皮石斛；多糖；微生物发酵；抗氧化活性

中图分类号：S567.23+9 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）10-1934-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.10.033

Study on the Extraction and Antioxidant Activity of Dendrobium candidum Polysaccharides Obtained by Microbial Fermentation

AN Quan1，XU Dan-ni2，LI Guang-min2，WANG Lian-chun2，LI Meng2，SU Ning3，WANG Chang-tao2

（1. Yunnan Baiyao Group Co.， Ltd.， Kunming 650504，China； 2. Beijing Industry and Commerce University Faculty of Science/Beijing Municipal Key Laboratory of Plant Resources Research and Development， Beijing 100048，China； 3. Cosmetics Technology Center of China Inspection and Quarantine Institution， Beijing 100176，China）

Abstract： Using microbial fermentation method to extract polysaccharides from Dendrobium candidum，solid-liquid ratio and fermentation pH were selected as single factors for polysaccharides extraction，and to evaluate the antioxidant activity of polysaccharides in vitro. The optimum conditions obtained by two factors and three levels orthogonal method of Dendrobium candidum polysaccharides extraction were as follows：the solid-liquid ratio was 1∶90，the pH value was 5，the polysaccharides extraction ratio in this condition was 42.86%；experiments were operated on scavenging the hydroxyl radical，DPPH radical and superoxide anion radical of the polysaccharides extract by microbial fermentation， results showed that crude Dendrobium candidum polysaccharides had certain antioxidant activity and the antioxidant activity showed dose-effect relationship at selected concentrations.

Key words： Dendrobium candidum； polysaccharides； microbial fermentation； antioxidant activity

石斛是中國传统名贵药材，有较好的药用价值。铁皮石斛为其中之极品，为兰科石斛属附生草本植物类[1]。铁皮石斛中含有的主要活性成分为石斛多糖、石斛碱、氨基酸、芪类及其衍生物以及多种挥发性成分，多糖是其最主要的有效成分，具有增强免疫、抗疲劳、抗氧化、降血压、降血糖、抗肿瘤等作用[2-4]，在化妆品原料开发中具有很好的应用前景[5]。石斛多糖是铁皮石斛中最重要的有效成分。提取铁皮石斛多糖有酶提法、酸提法、碱提法、水提法、超声提取等方法[6-8]。本试验采用微生物发酵法研究铁皮石斛多糖的最佳提取条件。

1 材料与方法

1.1 材料试剂

铁皮石斛，浙江义乌鲜禾有限公司；乳酸菌，北京川秀科技有限公司；氢氧化钠、盐酸、苯酚、浓硫酸、过氧化氢、硫酸亚铁、水杨酸、DPPH、无水乙醇、抗坏血酸、弱碱性（Tris-HCL）缓冲液、邻苯三酚、D-无水葡萄糖标准品均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器设备

DHG-9030A电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司；TB-214分析天平，北京富海科技有限公司；RJ-TDL-5A低速台式大容量离心机；LDZX-50FBS立式压力蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂；PHS-3CpH计；UVmini-1240紫外分光光度计，北京普析通用仪器有限公司；YT-CJ-IND超净工作台，北京亚泰科技仪器技术公司。

1.3 铁皮石斛多糖提取与测定

1）材料预处理。将铁皮石斛样品洗净、晾干，切成1～2 cm长的细段，于60 ℃的烘箱中烘干至恒重。粉碎，过40目分子筛，备用。

2）葡萄糖标准曲线的绘制。准确称取无水葡萄糖0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g加水溶解，于10 mL容量瓶中定容，吸取1 mL各浓度葡萄糖溶液，加入1 mL 5%苯酚溶液，摇匀，加入5 mL浓硫酸，摇匀。5 min后封管，置沸水浴中1 h，取出，冷却至室温，用去离子水代替待测液做空白对照，于490 nm下测其吸光度，以浓度为纵坐标，吸光度为横坐标，绘制标准曲线。

3）生物轉化法提取铁皮石斛多糖工艺流程。准确称取一定量的铁皮石斛于锥形瓶中，置于高温灭菌锅中灭菌25 min，于超净台内按照1∶100用量添加乳酸菌，培养箱中培养6 h，灭菌，待其冷却至室温，进行汁渣分离，弃沉淀，得多糖粗提液。从上述粗提液中，取2 mL于离心管中，加入10 mL无水乙醇。冷藏静置1 h，离心10 min，弃上清液。沉淀以80%乙醇溶液洗涤2次，弃上清液，加水溶解，定容至50 mL，得铁皮石斛多糖溶液。

4）铁皮石斛多糖含量的测定（苯酚-硫酸法）。吸取待测液2 mL，另取2 mL去离子水做空白对照，于具塞试管中分别依次添加1.0 mL 5%苯酚溶液，混匀后加入5.0 mL浓硫酸，再次混匀，5 min后封管沸水浴1 h。取出后冷却至室温，在490 nm处测吸光度。

1.4 铁皮石斛多糖抗氧化性的测定

1）对羟自由基清除作用的测定（水杨酸法）。在25 mL比色管中加入2 mmol/L FeSO4 3 mL、 1 mmol/L H2O2 3 mL，摇匀；其中H2O2最后加入并启动整个反应。接着加入6 mmol/L水杨酸3 mL，摇匀；于37 ℃水浴加热15 min后取出，测其吸光度（A0）；然后分别加入一定浓度的待测液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL；再分别加入蒸馏水0.8、0.6、0.4、0.2、0.0 mL，摇匀，继续水浴加热15 min，取出测其吸光度（AX）。为消除后加的共1.0 mL待测液和蒸馏水所造成的体系吸光度的降低，方法同上，恒温15 min后测其吸光度（A00），加入1 mL蒸馏水，摇匀后再测一次吸光度（AXX），即A降低=A00-AXX。

羟自由基清除率=[（A0-AX-A降低）/A0]×100%

2）对DPPH自由基清除作用的测定（DPPH法）。取等体积的待测液与2×10-4 mol/L的DPPH溶液混匀（A1）；取等体积的无水乙醇（待测物溶剂）与2×10-4 mol/L的DPPH溶液混匀（A2）；取等体积的无水乙醇与待测液混匀（A3）；反应30 min后，在517 nm下测A1、A2、A3管吸光度。

DPPH自由基清除率=[（A2+A3）-A1]/A2×100%

2 结果与分析

2.1 葡萄糖标准曲线的绘制

采用紫外-分光光度法测葡萄糖标准品不同浓度下的吸光度，由葡萄糖吸光度标准曲线（图1），得回归方程y=0.100 2x-0.005，相关系数为0.999 5，表明0.2～1.0 mg/mL葡萄糖浓度与吸光度呈良好线性关系。

2.2 生物转化法中单因素对铁皮石斛多糖提取率的影响

2.2.1 料液比对多糖提取率的影响 选用乳酸菌为发酵菌种，调节pH至5.6，设置料液比为1∶60、1∶70、1∶80、1∶90、1∶100（g/mL，下同）共5个梯度，3个平行组。由图2可知，随着料液比中石斛样品的增加，多糖提取率上升。故取料液比1∶80、1∶90、1∶100做后续正交试验。

2.2.2 pH对多糖提取率的影响 以乳酸菌为发酵菌种，料液比为1∶100，设置pH为3、4、5、6、7共5个梯度，3个平行组。由图3可知，pH为3时多糖提取液出现明显沉淀物，影响试验结果，故作为误差点舍去。随着pH的增加，多糖提取率上升。故取pH为5、6、7作为后续探究试验的条件。

2.2.3 探究生物转化法提取铁皮石斛多糖最佳工艺条件 以微生物发酵铁皮石斛单因素试验结果为依据，以料液比（A）、pH（B）为考察因素，以铁皮石斛多糖提取率为考察指标，根据正交试验设计（表1）进行L9（32）试验，按照表1中的因素设计并进行正交试验，结果见表2、表3。

由表2、表3可知，通过比较极差大小R值可以看出对铁皮石斛多糖提取率的影响因素A>B，即料液比对提取率影响大于pH。各因素最佳提取工艺为A2B1，即料液比为1∶90、pH为5，此条件下多糖得率为42.86%。

2.3 铁皮石斛抗氧化性结果分析

2.3.1 对羟自由基的清除作用 由图4可知，铁皮石斛多糖对羟自由基具有清除作用，且随浓度的增加，清除率趋近向直线式增长，表现出一定的抗氧化性功效。

2.3.2 对DPPH自由基的清除作用 由图5可知，微生物发酵法制备的铁皮石斛多糖对DPPH自由基的清除作用明显，且清除率随浓度的增加而增强，具有较好的抗氧化能力。

3 结论

本试验通过探究微生物发酵法提取铁皮石斛多糖最佳工艺条件并研究铁皮石斛生物粗多糖抗氧化活性得出结论，在料液比为1∶90，pH为5时，生物转化法提取铁皮石斛多糖最高提取率为42.86%；铁皮石斛多糖表现出一定的抗氧化活性，对羟自由基和DPPH自由基均有一定的清除作用。

参考文献：

[1] 李 娟，李顺祥，黄 丹，等.铁皮石斛资源、化学成分及药理作用研究进展[J].科技导报，2011，29（18）：74-79.

[2] 刘静平，朱先红，贾景明.正交试验优选铁皮石斛类原球茎多糖的提取纯化工艺[J].中国药房，2011，22（15）：1378-1380.

[3] 包英华.铁皮石斛种质资源的鉴定与评价研究[D].广州：广州中医药大学，2014.

[4] 吕圭源，颜美秋，陈素红，等.铁皮石斛功效相关药理作用研究进展[J].中国中医药杂志，2013，38（4）：489-493.

[5] 陈 默，孙 懿，赵 亚，等.铁皮石斛提取物保湿性能研究[J].上海中医药大学学报，2015，29（6）：70-73.

[6] 黄晓君，聂少平，王玉婷，等.铁皮石斛多糖提取工艺优化及其成分分析[J].食品科学，2013，34（22）：21-26.

[7] 王建明，古 力，康智明，等.铁皮石斛多糖的提取工艺优化及其抗氧化活性研究[J].西北农林科技大学学报（自然科学版），2013（12）：143-148.

[8] 尚喜雨.水提法·酶法提取铁皮石斛多糖的比较研究[J].安徽农业科学，2010，38（18）：9787-9788.