响应面优化鱼鳔胶原肽制备工艺及其抗氧化活性研究

涂宗财，唐平平，郑婷婷，庞娟娟，张露，沙小梅，王辉

1(江西师范大学 功能有机小分子教育部重点实验室&生命科学学院，江西 南昌，330022)2(南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌，330047)

响应面优化鱼鳔胶原肽制备工艺及其抗氧化活性研究

涂宗财1,2*，唐平平1，郑婷婷1，庞娟娟1，张露1，沙小梅1，王辉2

1(江西师范大学 功能有机小分子教育部重点实验室&生命科学学院，江西 南昌，330022)2(南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌，330047)

鱼鳔富含胶原蛋白，营养价值高，但目前对鱼鳔的加工利用不足，造成资源浪费、环境污染。以草鱼鱼鳔为原料，以DPPH自由基清除能力为评价指标，通过单因素和响应面实验优化酶解鱼鳔胶原蛋白制备抗氧化活性肽的最佳工艺，并研究其体外抗氧化活性。结果表明：抗氧化活性肽的最佳制备工艺为，以风味蛋白酶为酶制剂，酶解时间79.34 min，料液比为3.09∶100(g∶mL)，酶添加量为6 343.43 U/g，在此条件下制备的鱼鳔胶原肽的DPPH自由基清除能力达79.98%。鱼鳔胶原肽清除DPPH自由基、羟自由基的IC50分别为8.05 mg/mL和3.54 mg/mL，并且具有较强的还原力。因此，鱼鳔胶原肽具有较强的抗氧化活性，草鱼鱼鳔是制备抗氧化活性肽的良好原料。

鱼鳔；胶原蛋白；肽；抗氧化活性

活性氧自由基(ROS)是有氧生物细胞代谢过程中产生的一类高活性物质。在机体内，自由基会不断被体内抗氧化酶如超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)和过氧化氢酶(CAT)清除。当人体中ROS过量时，易导致一系列人类疾病，如神经退化、糖尿病、衰老、癌症等[1-2]。ROS中DPPH自由基活性最高，羟自由基毒性最强，超氧阴离子自由基可导致机体中毒。目前使用的自由基清除剂主要有BHA、BHT、TBHQ等，但这些抗氧化剂为合成抗氧化剂，易引发DNA、蛋白质损伤及本身的毒性危害[3]。因此，从食源蛋白中提取天然抗氧化活性肽已逐渐成为研究热点之一。

鱼加工过程中产生大约40%的副产物，其中鱼鳔约占1%[4]，根据2016渔业年鉴统计结果，2015年草鱼的总产量567.62万t计算，鱼鳔产量约为2.27万t，产量较大。且鱼鳔富含胶质，胶原蛋白含量高达80%以上[5]，可作为良好、丰富的胶原蛋白资源。但是，目前除少部分鱼鳔(特别是淡水鱼鱼鳔)直接被食用或加工为干制品外，大部分被当做废弃物丢弃，造成大量的资源浪费和严重的环境污染。胶原蛋白肽是胶原蛋白经酶降解得到的一系列由3～20个氨基酸组成的多肽[6]。研究表明，水产品尤其是鱼类加工副产物可制备具有抗氧化活性的胶原肽，目前国内外研究者已从鱼皮[7-9]、鱼骨[10-12]、鱼鳞[13-14]等副产物中制备除抗氧化胶原肽。但目前对鱼鳔胶原肽研究极少，只有刘姝[15]等直接以鳙鱼鱼鳔原材料，通过米曲霉发酵制备抗氧化活性肽，但该法耗时长，达40 h，且产物的抗氧化活性不高，超氧阴防子自由基和羟自由基的清除率分别为52%和78%。

针对鱼鳔资源加工利用不足，鱼鳔胶原肽研究不够深入，鱼源胶原肽活性不高等问题，本文先从草鱼(Ctenopharyngodonidellus)鱼鳔中提取明胶，然后以DPPH自由基清除率为指标，采用酶法降解鱼鳔明胶，通过单因素及响应面试验优化鱼鳔明胶制备抗氧化胶原肽的制备工艺，并对其体外抗氧化活性进行了研究。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

草鱼鱼鳔(平均长度(20.3±1.4) cm、质量(15.29±2.5) g)，由南昌市鄱阳湖农牧渔产业发展股份有限公司提供，鱼鳔在公司经冷库冰冻，加冰块包装好1 h内运送到实验室，新鲜鱼鳔经清洗后放-20℃保存备用(1个月内使用)。

风味蛋白酶(2.6×104U/g)、碱性蛋白酶(17.3×104U/g)、中性蛋白酶(5.0×104U/g)，诺维信生物技术有限公司；胰蛋白酶(26.7×104U/g)、木瓜蛋白酶(17.1×104U/g)，江苏锐阳生物技术有限公司；1,1-二苯基-3-硝基苯肼，美国Sigma公司；还原型谷胱甘肽，北京索莱宝有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器和设备

LGJ-1D-80型冷冻干燥机，北京亚泰科隆仪器技术有限公司；ESJ200-4型电子天平，沈阳龙腾电子有限公司；UV-3200型紫外-可见分光光度计，上海美普达仪器有限公司；synergH1型酶标仪，美国伯腾仪器有限公司；5430R型离心机，艾本德中国有限公司；KDY-9820型凯氏定氮仪，北京瑞邦兴业科技有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 鱼鳔明胶的提取[16]

称取适量的草鱼鱼鳔，剪成(1 cm×1 cm)的小块，按料液比1∶3(g∶mL)加入0.15%的NaOH，浸泡1 h后水洗至中性，再按1∶3的料液比加0.15%的H2SO4溶液，静置1 h后水洗至中性，最后用80 ℃热水浸提2 h，双层滤纸过滤，滤液冷冻干燥后备用。

1.3.2 鱼鳔明胶蛋白含量的测定[17]

参照GB 5009.5—2010《国家食品安全标准 食品中蛋白的测定》中凯氏定氮法测定鱼鳔明胶蛋白质含量。

1.3.3 蛋白酶的选择

将鱼鳔明胶配制成蛋白质含量为20 mg/mL的溶液，加酶酶解，酶解条件见表1。酶解结束后，沸水浴灭酶10 min，7 500 r/min离心10 min，取上清液测定DPPH自由基清除率和游离氨基氮含量，筛选出最适蛋白酶。

表1 5种蛋白酶的酶解条件

1.3.4 酶解工艺研究

1.3.4.1 单因素试验

通过1.3.2筛选出水解鱼鳔明胶的最适酶，以酶解液的DPPH自由基清除率及游离氨基氮含量为指标进行单因素实验。分别研究料液比(g∶mL)(1∶100、2∶100、3∶100、4∶100、5∶100)、酶解温度(40、45、50、55、60、65 ℃)、反应pH(5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5)、反应时间(15、30、45、60、75、90 min)、酶添加量[E/S](2 000、4 000、6 000、8 000、10 000 U/g)对鱼鳔明胶酶解液DPPH自由基清除率和游离氨基氮含量的影响。

1.3.4.2 响应面试验

在单因素的基础上，以DPPH自由基清除率为响应值，选择对酶解产物抗氧化性影响较强的3个因素(酶添加量、反应时间、料液比)进行3因素3水平的响应面试验。

1.3.5 游离氨基氮含量的测定

采用茚三酮法[18]测定游离氨基氮含量。

1.3.6 抗氧化活性研究

1.3.6.1 DPPH·清除能力测定[19]

用95%乙醇配制0.2 mmol/L DPPH，取100 μL酶解液与100 μL DPPH溶液于96孔酶标板混合均匀，常温避光反应30 min，517 nm处测定吸光值A1。以100 μL 95%乙醇代替DPPH溶液与100 μL去离子水反应为空白组(A0)，以100 μL DPPH溶液与100 μL去离子水反应为对照组(A2)。DPPH·清除率计算公式如下：

DPPH自由基清除率/%=(A2-A1)/(A2-A0)×100

(1)

1.3.6.2 羟自由基清除能力的测定[20]

取1.0 mL酶解液依次加入2 mL 1.8 mmol/L FeSO4，1.5 mL 1.8 mmol/L 水杨酸-乙醇和0.1 mL 8.8 mmol/L H2O2，37℃水浴30 min。反应结束后取200 uL混合液于96孔酶标板，510 nm处测定吸光值Ai，以去离子代替样品液的吸光值为A0。羟自由基清除活性计算公式如下：

羟自由基清除率/%=[(A0-Ai)/A0]×100

(2)

1.3.6.3 还原力的测定

采用铁氰化钾还原法[21]测定水解产物的还原能力。

2 结果与分析

2.1 蛋白酶的筛选

由图1-A可知，5种蛋白酶中以风味蛋白酶制备的肽具有最高的DPPH自由基清除能力，达到73.71%，其后依次是木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶和胰蛋白酶。由于游离氨基含量可间接反应出蛋白质水解度，酶解液中游离氨基含量越高，水解度越大[22]。从图1-B中可以看出，风味蛋白酶水解液中游离氨基氮含量最高，达到3 236.38 μg/mL。由此可知，在酶活力及酶解时间相同情况下，风味蛋白酶酶解鱼鳔明胶的效率最高，制备得到的肽具有最强的抗氧化活性，因此，选择风味蛋白酶为后续试验优化鱼鳔胶原肽制备工艺的蛋白酶。

图1 不同蛋白酶酶解对鱼鳔胶原肽DPPH清除率(A)及游离氨基氮含量(B)的影响Fig.1 Effect of protease on DPPHscavenging rate(A) and free amino nitrogen content(B) of collagen peptide from swimming bladder

2.2 风味蛋白酶酶解鱼鳔明胶制备抗氧化肽单因素试验

如图2-A所示，pH值为6.0时，鱼鳔胶原肽的DPPH自由基清除率及游离氨基氮含量均达到最大。这可能是由于酶具有最适pH，pH值过高或过低都会降低酶的活力[23]。图2-A中结果表明，风味蛋白酶对鱼鳔明胶的最适pH值为6.0，过高或过低均可降低胶原肽的DPPH自由基清除率及游离氨基氮含量，表明6.0为风味蛋白酶制备鱼鳔明胶抗氧化肽的最适pH值。

图2 pH(A)、酶解温度(B)、酶解时间(C)、酶添加量(D)、料液比(E)对鱼鳔胶原肽DPPH清除率及游离氨基氮含量的影响Fig.2 Effect of pH(A)、 temperature(B)、 hydrolytic time(C)、 emzyme concentration(D)、liquid-to-material(E)on DPPH scavenging rate and free amino nitrogen content of collagen peptide from swimming bladder

由图2-B可以看出，随着酶解温度升高，鱼鳔胶原肽的DPPH自由基清除率及游离氨基氮含量呈先增大后降低的趋势，当酶解温度达到50 ℃时，具有最高的DPPH自由基清除率及游离氨基氮含量，分别为72.25%和3 409.28 μg/mL，这可能是因为温度过高会导致酶活力降低甚至失活[24]。因此，风味蛋白酶酶解的较适温度为50 ℃。

图2-C表明，随着反应时间的延长，鱼鳔胶原肽DPPH自由基清除能力及游离氨基氮含量越来越高。当酶解时间为75 min时达到最高，随后降低，游离氨基氮含量则平缓降低。这可能是因为酶解反应到一定时间后，进一步酶解会切断一些抗氧化多肽片段[25]，导致酶解液DPPH自由基清除率的降低。综合考虑，酶解时间定为75 min。

由图2-D可知，鱼鳔胶原肽DPPH自由基清除能力及游离氨基氮含量随着酶添加量的增加呈先升高后趋于平缓的趋势。这可能是因为随着酶量的增加，酶与底物达到饱和，酶进一步添加DPPH自由基清除能力及游离氨基氮含量不再增加。当酶添加量为6 000 U/g鱼鳔明胶蛋白时，DPPH自由基清除能力及游离氨基氮含量最高。因此，选择最适酶添加量为6 000 U/g。

从图2-E的结果可知，料液比在(1∶100～3∶100)(g∶mL)范围内，随着料液比的升高鱼鳔胶原肽的DPPH自由基清除能力及游离氨基氮含量逐渐增大；料液比超过3∶100后，进一步增大料液比鱼鳔胶原肽DPPH自由基清除能力及游离氨基氮含量开始缓慢降低。这可能是由于料液比较低时，酶量多于底物，随着料液比增加，底物浓度升高，底物多于酶量，进一步增加已没有多余的酶与底物反应[26]。因此，最适料液比为3∶100。

2.3 响应面试验

响应面试验结果如表2所示，用Design Expert 8.0软件对上述结果进行分析，回归模型方差分析见表3。

表2 响应面试验设计及结果

软件分析结果得到二次多项式回归方程为：

R=79.66+1.4X1+0.9X2+0.97X3-0.06X1X2+0.34X1X3-1.08X2X3-2.42X12-4.16X22-2.57X32

表3 回归模型方差分析

由表3可知，模型P<0.000 1表示模型为极显著。失拟项P值为0.1155(大于0.05)，表示模型预测值与实际误差值较小。分析模型各系数的P值可

得，因素X1、X2、X3、X2X3、X12、X22、X32项的P<0.05，说明反应时间、料液比和酶添加量的一次项和二次项，以及料液比和酶添加量的交互作用对鱼鳔胶原肽的DPPH自由基清除能力具有显著影响。通过对DPPH自由基清除率的回归方程进行显著性检验发现，模型相关系数R2=0.979 8，表示预测值与实测值之间具有很高的相关性；Radj2=0.953 8，表明此模型能解释95.38%的响应值变化，仅有总变异的4.62%不能解释。因此，该模型可以描述风味蛋白酶对草鱼鱼鳔明胶酶解制备胶原肽的变化规律，此模型能较好的优化试验方案。剔除不显著项X1X2、X1X3，再对方程进行优化，得方程：R=79.66+1.4X1+0.9X2+0.97X3-1.08X2X3-2.42X12-4.16X22-2.57X32

图3为料液比与酶添加量的等高线和响应面图。

图3 料液比和酶添加量对DPPH自由基清除率影响的响应面图与等高线图Fig.3 Ration of solid to liquid and cmzyme content on DPPH scavenging rate of response surface chart and contour plots

等高线的形状可反应交互作用的强弱，椭圆表示交互作用显著，圆形则表示不显著。图3可知，料液比与酶添加量之间具有显著的交互作用，这与表3的结果一致。采用软件分析得到风味蛋白酶酶解鱼鳔明胶的最优工艺条件：反应时间为79.34 min、料液比为3.09∶100、酶添加量6 343.43 U/g。此时鱼鳔胶原肽的DPPH自由基清除率理论值可达79.98%。按照该条件进行DPPH自由基清除率的验证性实验，重复6次计算平均值，DPPH自由基清除率为81.25%。与理论值的相对误差为1.57%。说明此模型可以较好的模拟和预测鱼鳔胶原肽的DPPH自由基清除率。

2.4 鱼鳔胶原肽抗氧化活性研究

以鱼鳔胶原蛋白为原料，采用风味蛋白酶在最佳酶解条件制备胶原肽，并对胶原肽的抗DPPH自由基清除率、羟自由基清除率和还原力进行测定，结果见图4。

图4 鱼鳔胶原肽的抗氧化活性：(A)DPPH自由基清除率、(B)羟自由基清除率、(C)还原力Fig.4 Antioxidant activity of collagen peptide from swimming bladder(a)，DPPH scavenging rate，(b)OH scavenging rate and (c) reducing power

由图4-A可知，随着鱼鳔胶原肽浓度的增加，样品对DPPH自由基的清除率逐渐升高，30 mg/mL达到最高81.27%，其IC50值为8.05 mg/mL。刘成梅[27]等研究的罗非鱼皮多肽(TSP-1)DPPH自由基清除率的IC50为13.96 mg/mL。刘文颖[28]等报道三文鱼鱼皮胶原肽对DPPH自由基清除率的IC50为14.95 mg/mL；夏光华[29]等采用三酶法制备罗非鱼皮胶原肽，其清除DPPH自由基的IC50为10.78 mg/mL。尹利端[30]等制备的鲤鱼鱼鳞胶原肽对DPPH自由基清除率的IC50为18.24 mg/mL。与这2种鱼皮胶原肽的DPPH自由基清除率相比，鱼鳔胶原肽具有更高的DPPH自由基清除能力，但稍低于绿鳍马面鲀鱼皮胶原肽[31]的IC50为5.22 mg/mL，低于谭洪亮[12]等分离纯化了的金枪鱼骨胶原肽的DPPH自由基清除能力(IC50=0.97 mg/mL)，这可能是因为鱼鳔胶原肽是粗酶解物，未经进一步的分离纯化。

从图4-B可知，在0～15 mg/mL内，鱼鳔胶原肽的羟自由基清除率随着浓度增大而升高，15 mg/mL后升高缓慢，IC50为3.54 mg/mL。马华威[32]等以鮟鱇鱼皮制备胶原活性肽，其对羟自由基清除的IC50为15.7 mg/mL。梁鹏[33]等研究了鲶鱼骨酶解物的羟自由基清除能力，IC50为6.47 mg/mL；尹利端[30]等以鲤鱼鱼鳞为原料制备胶原肽，其清除羟自由基的IC50为12.11 mg/mL。这3种胶原肽的羟自由基清除能力均低于本文的鱼鳔胶原肽。

图4-C结果可看出，鱼鳔胶原肽的还原能力具有良好的量效关系。随着多肽浓度升高，还原能力越来越强，当浓度达到30 mg/mL时，还原力相当于相同浓度下VC的一半。任俊凤[34]等对河豚鱼皮胶原肽进行超滤分离得到3 000～10 000 Da和1 000～3 000 Da和1 000 Da以下的3个肽段，其在浓度为30 mg/mL下的OD700 nm的值不到0.8。杨露[11]等制备的马面鱼骨多肽在60 mg/mL的OD700 nm的值仅约为0.6。2种胶原肽还原力均显著低于鱼鳔胶原肽。鱼鳔胶原肽具有较强的还原力。虽然鱼鳔胶原肽的DPPH自由基、羟自由基清除能力和还原力均低于VC和还原型谷胱甘肽，但优于大部分的鱼皮、鱼骨、鱼鳞胶原肽。综上，通过对鱼鳔胶原肽的体外抗氧化能力研究，表明鱼鳔胶原肽具有较强的抗氧化能力。

3 结论

鱼鳔为富含胶原蛋白的药食两用资源，但其加工利用程度却不高，本文通过单因素及响应面试验对草鱼鱼鳔明胶制备抗氧化肽的酶解工艺进行优化。确定最优工艺条件为：风味蛋白酶，酶解时间79.34 min，料液比为3.09∶100(g∶mL)，酶添加量为6 343.43 U/g，此时的DPPH自由基清除率达79.98%。体外抗氧化活性研究显示，鱼鳔胶原肽清除DPPH自由基和羟自由基的IC50分别为8.05 mg/mL和3.54 mg/mL，且具有较强的还原力，当质量浓度为30 mg/mL时，700nm处的吸光值达1.432 8。因此，鱼鳔明胶酶解产物具有较强的抗氧化能力，可作为制备抗氧化活性肽的资源，本研究对促进鱼鳔资源的开发和高值化利用具有重要参考意义。

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Optimization of swimming bladder collagen peptide preparation using response surface methodology and its antioxidant activity research

TU Zong-cai1,2*, TANG Ping-ping1, ZHENG Ting-ting1, PANG Juan-juan1,ZHANG Lu1, SHA Xiao-mei1, WANG Hui2

1(Key Laboratory of Functional Small Organic Molecule, Ministry of Education, College of Life Science, Jiangxi Normal University, Nanchang 330022, China)2(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

Swim bladder is rich in collagen, high in nutrition, but it is waste and cause environmental pollution due to lack of processing technology, causing severe waste and environmental pollution. The technology parameters of enzymatic hydrolysis swim bladder in preparing collagen peptide through single factor experiment and response surface methodology was optimized, DPPH· scavenging ability was used as the indicator. The antioxidant activities of peptide prepared under the optimal condition were also evaluated. Results indicated that the optimal conditions for preparing antioxidant peptides were: Flavourzyme hydrolyzing for 79.34 min, liquid-to-material of 3.09%, emzyme-collagen ratio of 6 343.43 U/g. Under the above conditions, the DPPH· scavenging ability of swim bladder collagen peptide was 79.98%. The IC50value for DPPH· and ·OH scavenging ability was 8.05 mg/mL and 3.54 mg/mL, respectively. The peptide also exhibited relatively strong reducing power. Therefore, swim bladder is a good source in preparing swim bladder collagen with strong antioxidant activity.

swimming bladder; collagen; peptides; antioxidant activity

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201705026

博士，教授，(本文通讯作者，E-mail: tuzc_mail@aliyun.com)

江西省重大生态安全问题监控协同创新中心资助项目(No,JSX-EW-00)；江西省现代农业产业技术体系建设专项资金资助(No,JXARS-04)

2016-08-16，改回日期：2016-10-08