链霉菌L10608产木聚糖酶纯化及特异水解底物生成益生元型产物研究

熊科，熊苏玥，崔晓亭，侯洁，鲍艺佳，孙佳月，李秀婷*

1(北京工商大学，北京食品营养与人类健康高精尖创新中心，北京，100048)2(北京工商大学，北京市食品添加剂工程技术研究中心，北京，100048)3(北京工商大学，北京市风味化学重点实验室，北京，100048)4(北京工商大学，北京市质量与安全重点实验室，北京，100048)

链霉菌L10608产木聚糖酶纯化及特异水解底物生成益生元型产物研究

熊科1,2，熊苏玥1,2，崔晓亭1,4，侯洁1,3，鲍艺佳1，2，孙佳月1，4，李秀婷1,2*

1(北京工商大学，北京食品营养与人类健康高精尖创新中心，北京，100048)2(北京工商大学，北京市食品添加剂工程技术研究中心，北京，100048)3(北京工商大学，北京市风味化学重点实验室，北京，100048)4(北京工商大学，北京市质量与安全重点实验室，北京，100048)

研究对前期筛选的一株产木聚糖酶菌株L10608进行鉴定，判定其为链霉菌。并对该菌株所产木聚糖酶进行纯化得到电泳级纯度木聚糖酶L10608-Xyn11。该酶蛋白质分子量为24 kDa。探究L10608菌株所产木聚糖酶以商品玉米芯木聚糖、商品燕麦木聚糖、自制水不溶性玉米芯木聚糖为底物时的水解特性，结果表明该菌所产木聚糖酶对木三糖有很强的水解作用，以自制水不溶性玉米芯木聚糖为底物水解时效果最为明显，底物中木三糖的含量下降了1.521 mg/mL，产物中木二糖增加了1.635 mg/mL，木糖仅增加了0.180 mg/mL。菌株L10608的酶解产物中低聚木糖的产量远高于木糖，且高产低聚木糖中的主要有效成分木二糖，其水解特异性表明该菌有潜力作为益生元型低聚木糖的生产菌株。

链霉菌L10608；木聚糖酶；分离纯化；益生元产物

木聚糖作为植物半纤维素的重要组分，是自然界中除纤维素以外含量最丰富的可再生生物质资源[1]。木聚糖可被降解用于生产低聚木糖，后者具有降低癌症风险、抗龋齿、降低血压、降低血清胆固醇、抑制病原菌和腹泻润肠通便等作用，可应用于酸奶、焙烤食品、功能性食品等[2]。目前，生物酶降解法是制备低聚木糖的主要方法之一[3]，木聚糖酶来源主要依靠真菌、细菌等微生物的发酵产生，链霉菌属在低聚木糖的工业化生产中已实现初步的应用[4-5],具有一定的安全性与应用潜力。而目前酶法生产采用微生物来源的木聚糖酶水解木聚糖时除了存在菌株本身产酶活力低下外，水解产物中木二、木三糖等特异性成分含量也大多低于30%且含大量木糖、阿拉伯糖等非功能性成分，导致后期需要较复杂的工艺和高额的成本来对酶解产物进行提纯，以提高功能低聚木糖纯度(60%～70%)[6-7]。目前报道的只有极少数菌株具有底物水解高酶活力,且水解底物时产物中木二糖、木三糖比例超过50%[8]。

微生物来源的木聚糖酶普遍存在于自然界中且种类繁多，其中细菌和霉菌来源的木聚糖酶研究较多[9]。本实验从土壤中筛选得到1株L10608菌株，在前期已完成其液体发酵条件优化及水解特性初步研究发现其适合以农业废弃物玉米芯木聚糖为底物，开展水解产物特异性的研究。基于此本研究通过形态学、分子生物学手段对研究菌株进行鉴定，并纯化其所产木聚糖酶和对其产酶性质进行研究，针对目前酶法生产中反应过程难以控制，低聚木糖功能性成分产率低，提纯成本高，难以实现规模生产的问题。研究采用不同种木聚糖底物，用HPLC分析考察菌株所产木聚糖酶水解产物特性，以期为工业生产益生元型低聚木糖提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

链酶菌L10608(实验室筛选)；燕麦木聚糖和玉米芯木聚糖(VETEC)，细菌 DNA提取试剂盒(Sigma)；木糖标品 (木糖、木二糖、木三糖、木四糖)色谱纯，上海安谱实验科技股份有限公司；硝酸铵、盐酸、氢氧化钠、乙酸、醋酸钠、柠檬酸、三钠无水亚硫酸钠：分析纯，北京化工厂；玉米芯木聚糖(实验室提取)。

TCYQ培英台式恒温振荡器，苏州市培英实验设备有限公司；紫外可见分光光度计UV-2600，尤尼柯上海仪器有限公司；VEGA-LSU型扫描电子显微镜，捷克Tescan公司；SP-Sepharose柱填料，Healthcare公司；AKTAUPC-900蛋白纯化仪，美国GE公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒，Solarbio公司。

1.2 培养基

菌株发酵产酶培养基(g/L)：牛肉膏5，胰蛋白胨10，NaCl 5，琼脂20，定容至1L；液体摇瓶发酵培养基(g/L)：牛肉蛋白胨10，玉米芯木聚糖20，酵母膏3，NaNO32，KH2PO46，K2HPO41.5，MgSO4·7H2O 0.5，定容至1L。LB培养基(g/L)：氯化钠10，胰蛋白胨10，酵母浸粉5，定容至1L。上述培养基均要求pH 5.0，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。

1.3 产木糖酶菌株鉴定

将菌株在LB培养基37℃恒温箱培养2 d，在显微镜下进行菌株形态特征的观察与革兰氏染色反应。DNA的提取按照细菌DNA提取试剂盒的试剂说明书进行。引物为：Primer1: AGAGTTTGATCMTGGCTCAG，Primer2: TACGGCTACCTTGTTACGACTT。将提取的基因组 DNA 进行 PCR扩增[8]，PCR反应体系为10×PCR Buffer 2.5 μL，20 μmol/L Primer1 0.5 μL，20 μmol/L Primer2 0.5 μL， 2.5 mmol/L dNTP 4 μL，5 U/L rTaq酶0.3 μL，DNA 1.0 μL，ddH2O 17.5 μL[10]。 PCR扩增条件预变性95 ℃10 min，变性95 ℃ 30s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，再延伸72 ℃10 min，1 %琼脂糖凝胶电泳。送出测序后获得16S rDNA片段的基因序列，在 NCBI 中BLAST 分析与已登录基因序列进行比对，选择相似度最高的基因序列用Clustalx 1.8[9]进行多序列对比分析以及MEGA 6.0软件构建菌株的系统发育树。

1.4 木聚糖酶纯化

菌株液态发酵结束后，将发酵液10 000 r/min 离心10 min，收集上清液即为粗酶液。取550 mL的粗酶液在冰水浴中，缓慢加入(NH4)2SO4粉末，使(NH4)2SO4的浓度达30 %的饱和度，然后继续搅拌1 h，在10 000 r/min下离心10 min，上清液和沉淀收集测木聚糖酶活力和蛋白含量。向上清液中继续加入(NH4)2SO4，至(NH4)2SO4饱和度达到50%，10 000 r/min 离心10 min 收集沉淀。将沉淀用20 mmol /L的醋酸缓冲液(pH5.5) 溶解，在相同缓冲液体系中4℃透析过夜。

将上述发酵条件下产生的粗酶液经30%～50%(NH4)2SO4沉淀后得到部分提纯的酶液，利用AKTA蛋白纯化系统，进一步用SP-Sepharose离子交换树脂交换层析纯化酶蛋白。实验条件为：缓冲体系为pH8的0.02 mol/L Tris-HCl缓冲液；洗脱液为0～0.2mol/L NaCl溶液(溶于pH8的0.02 mol/L Tris-HCl)；以1 mL/min的流速；每管设定收集1 mL，收集样品备用。

1.5 酶活力测定

木聚糖酶活力测定参照DNS[11]法：将0.1 mL的酶液(适当稀释)，加到0.9 mL的质量分数为1%桦木木聚糖底物液中(底物液用pH5.5的0.05 mol/L的醋酸缓冲液配制)，在55 ℃下反应5 min，用1 mL DNS来终止反应，以木糖作标准，酶活力单位定义为在一定条件下，单位时间内生成1 μmol木糖所要的酶量(U)。蛋白浓度测定采用蛋白含量测定试剂盒。

1.6 木聚糖酶酶谱及分子量测定

聚丙烯酰胺凝胶电泳[12]在分离胶和浓缩胶质量分数为12.5%和4.5%的条件下进行，电泳后的凝胶用考马斯亮兰染色。变性状态下的酶谱分析是添加质量分数为0.1%桦木木聚糖到分离胶中，其他与SDS-PAGE一致，电泳后的凝胶用异丙醇(25%)与pH7.0的0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液各洗4次，然后在50 ℃反应15min，接着用质量分数为0.1%刚果红染色15 min，最后用NaCl溶液 (1 mol/L)脱色，直至出现透明斑。根据标准蛋白Marker在SDS-PAGE 中的相对迁移率对分子质量作图，求出该木聚糖酶的分子质量。

1.7 酶解产物HPLC分析

配置1mL反应体系：分别以500μL 20 mg/mL的实验室自制水不溶性玉米芯木聚糖、玉米芯木聚糖(VETEC)、燕麦木聚糖(Biotopped)为底物，10 U的酶液，用醋酸-醋酸钠缓冲溶液(pH5.5)补足至1 mL。将配置好的1 mL反应体系于55℃水浴锅水浴加热反应12 h，0.22 μm水相膜注入进样瓶中等待检测。色谱柱条件：糖分析柱(4.6ID×250mm,COSMOSIL)；实验条件：流动相为乙腈:水70:30，流速为0.8 mL/min，柱温箱温度30 ℃，示差折光检测器温度30 ℃，进样量20 μL。

标准品曲线绘制。分别吸取木糖、木二糖、木三糖、木四糖标准品溶于水中，依次稀释为浓度为：0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL的标准溶液，用0.45 μm微孔滤膜过滤，即得木糖、木二糖、木三糖、木四糖标准溶液系列。分别取20μL 标准系列溶液进样分析，以木糖、木二糖、木三糖、木四糖浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制木糖、木二糖、木三糖、木四糖的峰面积-浓度标准曲线。

以木糖、木二糖、木三糖、木四糖浓度为横坐标，以液相检测峰面积为纵坐标，其标准曲线分别为

式中：X1、X2、X3、X4分别为木糖、木二糖、木三糖、木四糖浓度(mg/mL)。Y1、Y2、Y3、Y4分别为木糖、木二糖、木三糖、木四糖峰面积。

降解率的计算是酶解后体系中木糖、木二糖、木三糖、木四糖含量的变化与空白底物中相应含量的比值。

2 结果与讨论

2.1 菌株鉴定

菌株L10608在LB培养基上(图1A)菌落为白色、表面湿润，菌体呈大小不等的圆形，菌落湿润不易挑起，长时间培养后菌体周围培养基呈深绿色，产生了色素。

图1 菌株L10608在LB培养基上及显微镜(10×100)下形态特征Fig.1 The morphological characteristics of strain L10608 on a LB medium and a microscope (10×100)

菌株在显微镜下的鉴定(图1B)显示了生长在LB培养基上的菌株L10608在显微镜下结构形态，从图中可以看出该菌株革兰氏染色呈阳性，具有分支状菌丝体菌体，细胞小，成链状排列，符合链霉菌的形态学特点。对菌株进行基因组DNA提取，随后进行PCR扩增，得到片段为1500bp左右的目的条带。将PCR扩增后的产物进行基因序列的测定，测序结果在NCBI数据库中BLAST比对，选取相似度最高(均在99 %以上)的10株菌株与该段基因序列进行比对，构建系统发育树(图3)。由系统发育树可以判断L10608为链霉菌，并与Streptomycessp.GY2序列相同源性最高为72 %。

图2 菌株L10608的基因发育树Fig.2 L10608 strain gene phylogenetic tree

2.2 木聚糖酶的纯化

注: M：低分子量标准蛋白；1：粗酶液；2：30%～50%硫酸铵沉淀；3：SP-sepharose离子交换层析；4：酶谱。图3 链霉菌L10608 Xyn11纯化图Fig.3 SDS-PAGE analysis of purified L10608-Xyn11

粗酶液经过硫酸铵沉淀、SP-Sepharose离子交换层析分离纯化后得到电泳级纯酶L10608-Xyn11 (图3)。图3表明经纯化的酶在SDS-PAGE凝胶上呈现单一条带且酶谱相对应位置出现透明条带，表明该纯化的木聚糖酶达到电泳纯级，根据标准蛋白Marker 在SDS-PAGE 中的相对迁移率可得该木聚糖酶的分子质量为24 kDa，纯化过程中酶活力回收率为4.62%，木聚糖酶纯化倍数为11.91，木聚糖酶的比酶活升高至4590.9 U/mg(表1)。研究发现由于链霉菌L10608 能够产生11族、10族两种木聚糖酶，而L10608-Xyn11 只是其中之一，因此导致该酶的纯化倍数与酶活回收率略低。这与菌株Trichodermasp. K9301[13]的研究结果类似，该菌也产生2种不同种类的木聚糖酶，其酶活回收率也略偏低。

表1 链霉菌L10608产木聚糖酶的纯化总结

研究显示，链霉菌木聚糖酶的分离纯化通常要经过多步分离，得到的木聚糖酶通常分为11族与10族两个水解酶家族，蛋白分子质量大多分别为20～25 kDa与30～55 kDa[14]，该酶分子量为24 kDa极可能属于11家族木聚糖酶。用Edman降解法测定L10608-xyn11N-末端的10个氨基酸残基序列用N端序列为ATTITTNQTG(Ala-Thr-

Thr-Ile-Thr-Thr-Asn-Gln-Thr-Gly)，经NCBI BLAST对比后发现与糖苷水解酶11家族Streptomycessp. JHA19 1,4-beta-xylanase(Sequence ID: WP_055619964.1)N端序列100%相似，可判断L10608-xyn11为11家族木聚糖酶。

2.3 酶解产物HPLC分析

由表2所示不同来源木聚糖酶在相同酶解条件下，水解不同底物后产物中木糖、木二糖、木三糖、木四糖含量变化情况(mg/mL)。

表2 不同来源木聚糖酶与水解不同底物后的木糖、木二糖、木三糖含量及降解率

结果表明，L10608-Xyn11与实验室另外2株菌同期筛选出的菌株L2524与L3221所产的木聚糖酶在同样酶解条件下，水解3种不同的木聚糖底物时，不同来源酶与不同底物水解后的木糖、木二糖、木三糖含量的变化差异明显。当水解玉米芯木聚糖(VETEC)底物时，从结果可知L10608-Xyn11对底物中木三糖的水解能力明显强于另外2株菌所产木聚糖酶，其对空白中木三糖的水解率达到了84%以上，使水解产物中木二糖的含量显著上升至空白样品的2.8倍，相对空白水解产生了1.035 mg的木糖。L10608-Xyn11与一些11族的木聚糖酶水解底物生成产物的性质不同，比如来自Bacillussubtilis的11族木聚糖BsXynA[15]以20 mg/mL榉木木聚糖为底物时其主要水解产物为木三糖。Qi Yang[16]等人从黑曲霉中纯化出一种水解终产物主要为木二糖的11族的木聚糖酶rAfxynA，rAfxynA水解10 mg/mL的榉木木聚糖时水解产物中含有木糖(0.61±0.04)μmol/mL，木二糖(6.05±0.14)μmol/mL，木三糖(2.47±0.22)μmol/mL，其对木三糖的水解特异性不高，水解率低。

在同样酶解条件下水解实验室自制水不溶性玉米芯木聚糖底物的结果表明，其与水解玉米芯木聚糖(VETEC)底物时情况相似，L10608-Xyn11对木三糖同样有很强的水解能力，导致水解产物中有大量的木二糖与部分木糖累积，相对空白水解产物中木二糖的含量增加了1.635 mg，木糖含量增加了0.180 mg。另外2株菌所产的木聚糖酶虽然超过了L10608-Xyn11对木三糖的水解率，但其木二糖的产率远低于L10608-Xyn11。可以判断L10608-Xyn11对玉米芯来源的木聚糖水解能力良好，对木三糖有较强的底物特异性。一般研究认为木二糖至木五糖均是较好的低聚木糖类双岐因子，虽然木三糖对某些益生菌如青春双歧杆菌的增殖能力与降低总糖含量的能力强于木二糖[17]，其降低培养液 pH 值的能力和木二糖及低聚木糖相当[18],但同时也有研究认为双歧杆菌倾向于优先利用聚合度较低的低聚糖[19-20]，因此在一定的水解时间内，木二糖的利用率可能高于木三糖。

表2中3株菌所产木聚糖酶在同样酶解条件下水解燕麦木聚糖(Biotopped)底物时，由于空白底物本身含有大量的木二糖、木四糖和少量木三糖，且无木糖。L10608-Xyn11酶解产物中木四糖与木二糖的含量下降，木三糖含量相对空白底物上升了0.340 mg，与水解玉米芯木聚糖底物的酶解结果相反。推测可能由于燕麦木聚糖中木二糖含量较高，常常会产生一些终产物抑制作用[21-22]，从而抑制了木三糖进一步分解为木二糖，且底物中大量木四糖水解为木三糖，因此产物中木三糖含量相对空白底物有所上升。为进一步验证L10608-Xyn11对木三糖的强水解能力，采用相同的实验条件对木三糖单品进行水解。发现水解产物中木糖和木二糖含量分别为0.655 mg和0.578 mg，木三糖已被完全水解。证明了L10608-Xyn11对木三糖的水解能力。结果图4所示。

图4 以木三糖为底物的酶解产物图(HPLC)Fig.4 Thehydrolysates when use xylotriose as substrate

链霉菌L10608产木聚糖酶的水解木聚糖底物可大量产生木二糖产物的特点与Meagher[23]等人对Aspergillusnigersp.中来源的木聚糖酶的研究结论相似。该研究发现此木聚糖酶围绕着催化位点存在8个结合位点，无法水解木二糖，推测可能是因为当木聚糖酶与木二糖只存在两个位点结合时(±1)，无法形成稳定的中间体参与水解反应。刘亮伟[24]等人通过构建发育树研究了木聚糖酶11家族木聚糖酶及10家族木聚糖酶两个家族的分子进化差别，认为10家族木聚糖酶族催化域结合底物位点数要比11家族木聚糖酶少一些，而11家族木聚糖酶需要多于4个底物结合位点，因此可能无法水解聚合度较低的木聚糖。而蛋白质分子量[25]及后续实验得到基因序列推断，链霉菌L10608产木聚糖酶属于11家族木聚糖酶。因此该酶也无法水解聚合度较低的木二糖。

有大量研究表明，当不同结构和组成成分的木聚糖与木聚糖酶结合时，由于木聚糖酶空间结构的容纳性，导致结合方式的改变引起产物发生变化。Ebringerova[26]等人分析了玉米芯木聚糖的结构，认为玉米芯可溶性木聚糖和水不溶性木聚糖的主要差别在于前者含较多的阿拉伯糖, 阿拉伯糖连接在木糖主链上形成较多的支链结构[27]，因此可能是较多的阿拉伯木聚糖侧链在空间结构上阻碍了酶与底物的结合，导致了L10608-Xyn11水解玉米芯木聚糖(水溶性木聚糖)与实验室自制木聚糖(水不溶性木聚糖)时，水不溶性木聚糖的水解效率是水溶性木聚糖的2倍。燕麦同属禾本科植物, 其木聚糖结构与玉米芯木聚糖的结构相似性较高但较多的分支侧链结构，燕麦木聚糖样品中含有约15%的葡萄糖残基和10%阿拉伯糖残基, 木糖残基仅占70%左右[28]，水解产物可能含有大量的葡萄糖醛、阿拉伯糖残基等侧链结构的异五糖，这样的结构影响了木聚糖酶对其的进一步降解降低。这导致了燕麦木聚糖作为水解底物时L10608-Xyn11对其水解效率较低。KatarínaKolenova[29]等人的研究也得出类似结果。他们认为来自链霉菌StreptomyceslividansXlnA的Xyn-11因为空间结构的原因无法水解带有葡萄糖醛酸侧链的木三糖，导致了水解产物组成和比例的改变。

3 结论

链霉菌L10608发酵液经硫酸铵沉淀和SP-Sepharose离子交换层析两步纯化后，得到分子量为24 kDa的电泳级纯酶(L10608-Xyn11)酶活力达到4 590.9 U/mg。同时，该酶对木三糖的水解能力非常强，有一定的底物特异性，可水解多种木聚糖产生低聚木糖木二糖，但同时会产生一定量的木糖，可以通过分子改造等手段进一步提升其水解底物形成低聚木糖的产率，使其在低聚木糖工业生产等方面具备良好的应用价值。

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Research on xylanase fromStreptomycessp. L10608 hydrolysis substrate to generate specific prebiotics product

XIONG Ke1,2, XIONG Su-yue1,2, CUI Xiao-ting1,4, HOU Jie1,3,BAO Yi-jia1,2, SUN Jia-yue1,4,LI Xiu-ting1,2*

1(Beijing Advanced Innovation Center for Food Nutrition and Human Health, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China)2 (Beijing Engineering and Technology Research Center of Food Additives,Beijing Technology and Business University, Beijing 100048,China) 3 (Beijing Key Laboratory of Flavor Chemistry，Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China) 4 (Beijing Laboratory for Food Quality and Safety, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China)

Preparation of oligosaccharide from xylan hydrolysis is an effective way to add value to hemicellulose material of agricultural waste recycling, which has enormous economic potential and environmental protection significance. A 24 kDa xylanase (L10608-Xyn11) fromStreptomycessp. L10608 was purified by ammonium precipitation and anion-exchange chromatography, and its hydrolysis products from three different xylan substrates were analyzed by HPLC. The xylanase fromStreptomycessp. L10608 displayed strong hydrolysis on xylotriose. The content of xylotriose in the substrate was decreased by 1.521mg/ml, that of xylobiose increased by 1.635mg/ml and that of xylose only increased by 0.180mg/ml. The yield of xylooligosaccharides in substrate hydrolyzed by L10608 strain was much higher than that of xylose, and the main effective component in xylooligosaccharides produce was xylobiose. It indicated that the xylanase fromStreptomycessp. L10608 had potential application prospect in prebiotics production.

Streptomycessp. L10608; xylanase; purification; prebiotics

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201705009

博士，副教授(李秀婷教授为通讯作者,E-mail：lixt@btbu.edu.cn)。

国家自然科学基金(31601408)；北京自然科学基金面上基金(6172003)；国家自然科学基金(31371723)

2016-10-20，改回日期：2017-02-10