满膛与净膛冷鲜鸡微生物污染特征分析

廖夏旖，潘 航，Narayan Paudyal，李国炜，刘亚杰，方维焕，李肖梁

(浙江大学动物科学学院 浙江大学动物预防医学重点实验室，浙江 杭州 310058)

满膛与净膛冷鲜鸡微生物污染特征分析

廖夏旖，潘 航，Narayan Paudyal，李国炜，刘亚杰，方维焕，李肖梁*

(浙江大学动物科学学院 浙江大学动物预防医学重点实验室，浙江 杭州 310058)

探索满膛与净膛方式屠宰加工的冷鲜鸡中重要微生物污染情况，以期为冷鲜鸡的微生物控制技术开发提供依据。研究分别采集屠宰加工后第0～2天的满膛鸡与净膛鸡的开膛处肌肉，采用国标法和实时荧光定量检测法进行总菌数检测以及大肠菌群、空肠弯曲菌等微生物分类计数，并使用SPSS软件进行统计学分析。研究结果表明，净膛鸡中菌落总数、大肠菌群数和空肠弯曲菌3个指标的检测合格率均低于满膛鸡；净膛鸡的总菌数和大肠菌群数显著高于满膛鸡；不同禽类屠宰场来源的满膛鸡总菌数和大肠菌群数差异显著，而净膛鸡差异不显著；在第0～2天低温(4 ℃)储存货架期内，净膛鸡的微生物污染变化与满膛鸡差异不显著，但净膛鸡中微生物的增殖速度较满膛鸡缓慢。16S rDNA检测，净膛鸡和满膛鸡中均存在多种微生物，但在种类上也存在着一定的差异，其中阴沟肠杆菌等7种微生物未在满膛鸡中检测到。净膛鸡和满膛鸡微生物均存在着超标现象；净膛鸡中的二次污染较为严重；在货架期保鲜方面，净膛鸡具有优势。结果为冷鲜鸡的微生物控制技术开发以及净膛工艺的优化提供依据。

满膛鸡； 净膛鸡； 净膛工艺； 二次污染

从“战胜”禽流感等禽类疾病传播、促进养禽业健康发展的长远计，加强家禽流通市场的管理，对活禽进行“集中屠宰、冷链供应、冰鲜上市”将是必然趋势。浙江、广东、上海等多个省份共关闭2 000余个活禽市场。根据《浙江省人民政府办公厅关于进一步加强人感染H7N9禽流感防控工作的通知》要求，自2014年7月1日起浙江省县市区主城区永久性关闭活禽交易市场。这意味着，冷鲜鸡将成为鸡肉的主要供应方式。消费习惯和模式的转变，对上市冷鲜禽的安全提出了更高的要求。

据国家卫计委关于2015年全国食物中毒事件情况的通报显示，微生物性食物中毒事件报告的中毒人数最多，共计3 181人，占总中毒人数的53.7%，可见食源性致病微生物是导致食品安全问题的最主要危险因素之一。而鸡肉是人们膳食中蛋白质的重要来源，有统计显示，禽肉在肉类消费结构中的比重自1982年起持续攀升，至2012年我国的禽肉产量达1 823万t[1]。研究表明[2-4]，我国肉鸡市场均有不同程度及不同种类的微生物污染，存在很大的安全隐患。满膛和净膛冷鲜鸡是目前市场上供应冷鲜鸡的两种重要的产品，尽管满膛冷鲜鸡供应已被命令禁止，但由于我国传统的消费习惯使然，市民更倾向于选择价格较低、胴体完整的满膛鸡[5]。净膛鸡与满膛鸡的微生物污染情况、货架期对其微生物分布特征的影响等研究甚少。

本研究旨在探明净膛与未净膛冷鲜鸡经屠宰加工工序以及货架期的微生物污染情况，以期为冷鲜鸡的屠宰场加工工艺的优化以及微生物控制技术开发提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

平板计数琼脂、结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)、煌绿乳糖胆盐肉汤(BGLB)、布氏肉汤、改良skirrow培养基、哥伦比亚琼脂培养基均购自北京路桥生物有限公司，无菌PBS缓冲液(pH值7.2 10 μmol·L-1)、琼脂糖凝胶、细菌基因组DNA抽提试剂盒购自北京天根生物工程公司，16S rDNA扩增产物测序由博尚公司完成，Vazyme AceQTM Qpcr Probe Master Mix试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司。16S rDNA的PCR扩增采用通用引物，针对C.jejuni中单拷贝基因mapA设计一对引物和一条探针，由上海捷瑞生物工程有限公司合成，序列见表1。

表1 靶基因名称及引物序列

目的基因引物名称引物序列产物大小/bp16SrDNA16S⁃F5′⁃ATCTAATGGCTTAACCATTAAAC⁃3′150016S⁃R5′⁃GGACGGTAACTAGTTTAGTATT⁃3′mapART⁃F5′⁃TGTCAAGCACAACTATTCCTC⁃3′126RT⁃R5′⁃TAAAAGAAGGGCAAAAGGT⁃3′TaqmanFAM⁃ACCGCATTAAAATTCACATCGACA⁃TAMRA

1.2 材料与仪器

手术刀、镊子、超净工作台、一次性无菌平皿、无菌袋、电子秤、均质器、恒温培养箱、酶联免疫检测仪、摇床、高温高压灭菌锅、烘箱、漩涡振荡器、离心机、恒温水浴锅、沸水浴锅、PCR仪、电泳仪、荧光定量PCR仪(Bio-RAD)、4 ℃冰箱、-20 ℃冰箱、厌氧培养罐、超纯水系统。

1.3 方法

1.3.1 样品采集与分组

选取杭州市3个禽类定点屠宰场，分别购买同一屠宰场、同一生产批次的10只净膛鸡和10只满膛鸡。冷鲜鸡购买后均单独置于无菌袋中送至实验室。取回后，每个屠宰场立即分别取5只净膛鸡和5只满膛鸡进行样品预处理，其余样品于4 ℃保存48 h后进行模拟货架期微生物生长、失活情况分析。

1.3.2 样品预处理

超净台内用无菌剪分别剪取开膛处的肉样，放在无菌平板内准确称量10 g(鸡胸肉5 g，最后一排肋骨下两侧5 g)，剪碎肉样放入盛有90 mL PBS缓冲液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打2 min，制成1∶10的样品匀液。每只鸡作为1个样本。

1.3.3 总菌数检测

菌落总数按照GB 4789.2—2010测定[6]。取1∶10的样品匀液1 mL作10倍连续稀释至10-5，不同稀释度的样品匀液于平板计数琼脂上进行涂板计数，每个稀释度做4个平行，每个平行取10 μL涂板。37 ℃恒温培养16 h，选取菌落数为15～150的无蔓延菌落生长的平板进行总菌落计数。

1.3.4 细菌种类检测

随机挑选37 ℃恒温培养16 h后的净膛鸡和满膛鸡样品对应平板各2个，每板挑取3个大小不一的菌落，接种于1 mL BHI中，37 ℃于120 r·min-1摇床培养24 h，水煮法提取DNA，16S rDNA PCR扩增后，送测序公司对产物双向测序。16S rDNA扩增反应条件95 ℃ 5 min，1 cycle；95 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，35 cycles；72 ℃延伸10 min。

1.3.5 大肠菌群计数

大肠菌群数按照GB 4789.3—2010测定[7]。取上述合适稀释度的样品匀液于VRBA平板上涂板计数，每个稀释度4个平行，每个平行10 μL，37 ℃恒温18 h。选取菌落在15～150的无蔓延菌落生长的平板计数，并挑选10个典型及可疑菌落于装有倒立杜氏试管的BGLB肉汤中37 ℃恒温24 h，观察产气情况。凡BGLB肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。平板计数结果乘以BGLB肉汤阳性管比例即实际大肠菌群菌落数。

1.3.6 空肠弯曲菌计数

Real-time PCR检测C.jejuni的方法由本实验室建立，简述如下。首先制备标准曲线。将冻存的C.jejuni划线至skirrow平板，待菌落长出后挑取单菌落于布氏肉汤中微需氧条件下42 ℃培养36 h，6 000 r·min-1离心10 min，弃上清，PBS洗涤一次，重悬沉淀调整D620至0.15 (菌液浓度约为109mL-1)，10倍梯度稀释。选取合适浓度的菌液于哥伦比亚琼脂培养基上点板计数，并与原菌液试剂盒法一起提取DNA，原菌液提取得到的DNA用双蒸水10倍稀释8个梯度，采用Vazyme AceQTM qPCR Probe Master Mix试剂盒与已点板计数的菌液DNA(参照DNA)一同进行荧光定量反应，绘制标准曲线。反应条件为95 ℃ 5 min，1 cycle；95 ℃ 10 s，56 ℃ 30 s，68 ℃ 15 s，40 cycles。其次进行待测样品荧光定量检测。取1∶10稀释的样品匀液2 mL(可简短离心以去除较大肉沫)，利用细菌基因组DNA试剂盒法抽提DNA，并与8个浓度梯度的标准空肠弯曲菌DNA同步荧光定量扩增。标准品2个重复，待测样3个重复。计算空肠弯曲菌数。

1.3.7 模拟货架期微生物生长/失活情况

分别对4 ℃保存48 h的5只净膛鸡和5只满膛鸡样品预处理，检测总菌数、大肠菌群数、空肠弯曲菌数及细菌种类，并记录结果。

1.3.8 统计学处理

先对实验数据进行格拉布斯(Grubbs)检验，剔除异常值，然后采用单因素方差分析检验，比较满膛鸡与净膛鸡开膛处肌肉中3种微生物的总体平均数以及货架期内冷鲜鸡肌肉中微生物在4 ℃冷藏保存的生长/失活情况。

2 结果与分析

2.1 满膛鸡与净膛鸡合格率

根据GB 16868—2005鲜、冻禽产品标准[8]，鲜鸡肉菌落总数不得超过106g-1，大肠菌群数不得超过104(100 g)-1，空肠弯曲菌不得检出。菌落总数检测结果显示，满膛鸡合格率为6.7%，净膛鸡为0；大肠菌群数检测结果显示，满膛鸡合格率为66.7%，净膛鸡合格率为26.7%；空肠弯曲菌检测结果显示，满膛鸡合格率为26.7%，净膛鸡合格率为13.3%。净膛鸡针对3个指标检测的合格率均低于满膛鸡。

2.2 满膛与净膛鸡微生物污染情况比较

满膛鸡与净膛鸡几种微生物污染情况比较见表2。净膛鸡的总菌数和大肠菌群数显著高于满膛鸡；两者空肠弯曲菌数经方差分析无显著差异。

表2 满膛鸡与净膛鸡微生物污染情况 lg g-1

注：同列数据后无相同小写字母表示在0.05水平差异显著。

2.3 不同屠宰场满膛鸡与净膛鸡微生物污染情况差异比较

来自杭州市不同定点禽类屠宰场的满膛鸡与净膛鸡微生物污染情况见图l。结果表明，屠宰场A、B、C三地满膛鸡总菌数分别为7.29、6.64和7.28 lg g-1，差异显著；大肠菌群数分别为5.15、5.13和6.69 lg g-1，差异极显著。净膛鸡总菌数分别为7.65、7.24和7.32 lg g-1，差异不显著；大肠菌群数依次为5.98、6.48和6.46 lg g-1，差异不显著。三地满膛鸡和净膛鸡空肠弯曲菌数差异均不显著。

图1 满膛鸡(a)、净膛鸡(b)在不同屠宰场中微生物污染情况差异

2.4 满膛鸡与净膛鸡低温冷藏下微生物污染变化

货架期对满膛鸡和净膛鸡微生物生长影响见图2。结果显示，4 ℃冷藏48 h后，肉鸡的总菌数与大肠菌群数均有显著增长。满膛鸡总菌数增长0.79 lg g-1，净膛鸡增长0.69 lg g-1；满膛鸡大肠菌群增长0.75 lg g-1，净膛鸡增长0.44 lg g-1。空肠弯曲菌数均显著减少，满膛鸡减少0.45 lg g-1，净膛鸡减少0.48 lg g-1。试验结果表明，4 ℃冷藏条件下不能有效抑制大部分微生物的增长，而空肠弯曲菌对低温不耐受，故能被有效抑制并减少。方差分析结果显示，满膛鸡与净膛鸡低温冷藏48 h时的总菌数、大肠菌群数和空肠弯曲菌数的变化差异不显著，但从变化趋势来看，净膛鸡相较于满膛鸡，其总菌数、大肠菌群数的增长速度较缓慢，空肠弯曲菌的减少速度较快。

图2 4 ℃贮藏48 h后满膛鸡与净膛鸡微生物污染变化情况

2.5 细菌种类

净膛鸡、满膛鸡中均携带的菌群具有高度种属多样性，每个屠宰场净膛鸡、满膛鸡携带的菌落有一定的共性，也存在一定的差异。其中满膛净膛鸡均携带的菌群主要包括不动杆菌属、气单胞菌属、肠杆菌属、柠檬酸杆菌属、克雷伯菌属，其中气单胞菌属为优势菌群；仅在满膛鸡中检测到的菌群有嗜泉气单胞菌、溶酪大球菌、霍氏肠杆菌、Comamonasjiangduensis。仅净膛鸡中检测到的菌群有蜂房哈弗尼菌、Acinetobacterparvus、鲍氏不动杆菌、阴沟肠杆菌、产气肠杆菌、阿氏肠杆菌、泡囊假单胞菌。

3 讨论

本研究显示，净膛鸡的总菌数、大肠菌群数及空肠弯曲菌数的合格率均低于满膛鸡，并且净膛鸡的以上3种微生物的计数平均值均高于满膛鸡，此外在净膛鸡中检测到满膛鸡中未检出的阴沟肠杆菌等7种微生物。这表明屠宰加工后净膛鸡的微生物污染情况比满膛鸡严重，且可能存在二次污染。屠宰加工虽对鸡胴体进行清洗消毒，但效果不理想，反而加重微生物污染情况，此结果与夏小龙[9]等与张秀丽[10]等对肉鸡屠宰加工过程污染微生物分析结果相符。

从屠宰加工工序来看，满膛鸡与净膛鸡的区别在于掏膛操作以及之后的预冷池消毒。规范的净膛工艺能够有效降低微生物数量，而国内的净膛工艺尚未优化成熟。在理想状态下，净膛操作可有效降低肉鸡自体携带的各种微生物。Irena等[11]对捷克某一屠宰场检测结果显示，随着去毛、净膛、冲洗、冷冻工序进行，总菌数与大肠杆菌数是逐级减少的。Keener等[12]研究表明，净膛能减少鸡胴体弯曲菌的数量。但是，去内脏过程中肠道易破损，肠道内携带的很多天然菌落会污染肉鸡胴体表面，使去内脏后胴体污染菌的种类和数量增加。同时，净膛后虽去除了自体微生物，但却也为加工过程中的细菌提供了新的表面皮肤供殖源。孙彦雨等[13]对净膛前后鸡胴体微生物进行了检测，发现去内脏后微生物多样性增加。李虹敏等[14]的研究成果中也有提到，净膛间工人手的微生物污染程度最高，在净膛后鸡胴体的微生物数量显著上升。掏膛造成的污染很大程度上是因为肠道破裂导致自体微生物溢出，继而污染设备及工人手，引发交叉污染。本试验检测的空肠弯曲菌作为致病菌，一旦进入人的食物链很容易导致感染或食物中毒现象的发生，而其源头很多时候是家禽屠宰过程中粪便的溢出使加工中的禽肉受到了弯曲菌的污染[15]。因此在屠宰过程中减少肠溶现象对减少肉鸡胴体微生物污染及保证鸡肉安全具有重要作用。

预冷过程对消除胴体微生物污染起着重要的作用，闵红等研究表明[16]，在预冷水中可检出大量微生物污染，这样非但对禽类胴体没起到消毒作用反而具有一定的污染。理想情况下，通过水的冲洗作用能冲洗掉胴体表面粘附的大部分细菌，并且4 ℃以下的水温和水中一定浓度的消毒剂能抑制绝大多数嗜温细菌的生长繁殖[14]，但由于嗜冷腐败菌经常定居在预冷水槽中及冷却用冰上，预冷过程也会导致交叉污染的发生[17-18]。预冷池中虽然加入了一定浓度的消毒剂，但仍樊静等[19]研究发现在加工过程中某些工序会产生交叉污染，后期的预冷过程会导致嗜冷菌的污染。预冷过程作为屠宰加工工序的关键减菌节点，应选择合适的减菌剂类别及浓度，合理控制预冷水的置换时间，定期清洗预冷池，以避免预冷池对禽肉胴体造成的二次污染。

在本次试验中不同屠宰场之间的满膛鸡总菌数与大肠菌群数差异显著，而净膛鸡不显著，这说明掏膛和预冷对于改变净膛鸡的微生物数量是有效的。分析差异原因，不同屠宰场的肉鸡来源不同，养殖环境与方式也不相同，故肉鸡体内的菌落种类与数量也不相同；屠宰加工仅对满膛鸡肉的皮肤进行冲洗消毒等操作，对改变其体内的微生物污染情况影响不大。因此满膛鸡的总菌数与大肠菌群数在不同屠宰场之间有显著的差异。而净膛鸡由于掏膛操作，去除了内脏，因此排除了来自不同屠宰场的肉鸡之间的差异；同时肉鸡的体内环境暴露在外，经过相似的屠宰加工环节，胴体的菌群生长状况趋于相同。因此净膛鸡的总菌数与大肠菌群数在不同屠宰场之间无显著差异。这些现象表明，净膛操作对于改变鸡胴体的微生物数量是必要的。

在48 h低温储存的货架期内，净膛鸡保鲜效果与满膛鸡未产生显著差异，但表现出总菌数、大肠菌群数的增长相对缓慢的趋势，这说明随着货架期的延长，净膛鸡的微生物数量控制相对满膛鸡具有优势。生鲜鸡肉的化学与物理减菌保鲜技术研究目前较为活跃[20]，在屠宰加工阶段有效控制微生物数量，肉鸡的货架期就能得以延长。

在当前各地纷纷出台关闭活禽市场的政策下，净膛鸡的屠宰包装和冰鲜上市是产品发展的必然结果。而净膛鸡微生物污染的现状表明，当前屠宰过程的污染情况仍然非常严峻，冷鲜鸡的微生物控制技术亟待开发与优化。

[1] 邹怡，王宝维. 我国禽产品发展现状与展望[J]. 家禽科学，2013(7)：3-7.

[2] 卢旭红，李鑫，阳宇恒，等. 北京市大型超市中冰鲜鸡肉微生物污染状况调查[J].中国食物与营养，2014(12)：10-13.

[3] 蒲承君，崔兴博，杜兰兰，等. 市售生鲜鸡肉5种主要食源性致病菌污染检测及分布概率评估[J]. 食品科学，2015，36(10)：201-205.

[4] 黄伟峰，雷高鹏，黄玉兰，等. 2012—2013年成都市生鸡肉中弯曲菌调查分析[J]. 中国食品卫生杂志，2015(S1)：21-24.

[5] 超市冷鲜禽购销两旺渐入正轨 农贸市场却不待见，杀白禽乘机“上位”[Z]. http://news.xinhuanet.com/food/2015-08/31/c_1116418450.htm.

[6] 中华人民共和国卫生部. GB4789.2—2010食品微生物学检验: 菌落总数测定[S]. 北京：中国标准出版社，2010.

[7] 中华人民共和国卫生部. GB4789.3—2010食品微生物学检验: 大肠菌群计数[S]. 北京：中国标准出版社，2010.

[8] 中华人民共和国卫生部 中国国家标准化管理委员会. GB16869—2005 鲜、冻禽产品[S]. 北京：中国标准出版社，2005.

[9] 夏小龙，刘书亮，彭珍，等. 肉鸡胴体分割过程中污染微生物分析及不同冲淋条件对产品减菌影响[J]. 食品工业科技，2015，36(9)：194-199.

[10] 张秀丽，炊慧霞，廖兴广, 等. 2011年河南省肉鸡养殖和屠宰加工过程弯曲菌污染状况主动监测[J]. 中国卫生检验杂志，2013，23(9)：2133-2135.

[12] KEENER K M, BASHOR M P, CURTIS P A, et al. Comprehensive review ofcampylobacter, and poultry processing[J]. Comprehensive Reviews in Food Science & Food Safety，2004，3(2)：105-116.

[13] 孙彦雨，周光宏，徐幸莲. 肉鸡屠宰过程中腐败微生物的污染情况分析[J]. 食品与发酵工业，2011，37(5)：199-203.

[14] 李虹敏，冯宪超，徐幸莲，等. 肉鸡屠宰加工及冷藏中的微生物污染来源及菌相分析[J]. 肉类工业，2008(6)：33-37.

[15] 王君玮，王娟，曲志娜，等. 空肠弯曲菌对动物源性食品安全的影响及对策[J]. 中国人兽共患病学报，2013，29(11)：1119-1123.

[16] 闵红，周志云，李秋菲，等. 禽肉屠宰过程中微生物污染状况调查研究[J]. 陕西农业科学，2016，62(7)：59-63.

[17] TODD E C D. Microbiological safety standards and public health goals to reduce foodborne disease[J]. Meat Science, 2004, 66(1):33-43.

[18] HINTON J R, CASON J A, KIMBERLY D. Tracking spoilage bacteria in commercial poultry processing and refrigerated storage of poultry carcasses[J].International Journal of Food Microbiology, 2004, 91 (2):155-165.

[19] 樊静，李苗云，张建威，等. 肉鸡屠宰加工中的微生物控制技术研究进展[J]. 微生物学杂志，2011，31(2)：80-84.

[20] 徐幸莲, 王金玉, 王济民. 2014世界鸡肉加工研究和技术发展报告[J]. 中国家禽，2015，37(10)：9-11.

(责任编辑：万 晶)

2017-01-21

浙江省科技厅重大科技专项重大农业项目(2014C02001)

廖夏旖(1994—)，女，硕士研究生，研究方向为食品微生物学，E-mail：xyliao@zju.edu.cn。

李肖梁，研究员，E-mail：xlli@zju.edu.cn。

10.16178/j.issn.0528-9017.20170545

TS251.1

A

0528-9017(2017)05-0864-05

文献著录格式：廖夏旖，潘航，Narayan Paudyal，等. 满膛与净膛冷鲜鸡微生物污染特征分析[J].浙江农业科学，2017，58(5)：864-869.