遵义市冰核细菌分离鉴定及拮抗细菌筛选

赵晨心，丁海霞，彭丽娟

(贵州大学 a.农学院， b.烟草学院， c.烟草工程重点实验室，贵州 贵阳 550025)

遵义市冰核细菌分离鉴定及拮抗细菌筛选

赵晨心a，丁海霞a，彭丽娟bc*

(贵州大学 a.农学院， b.烟草学院， c.烟草工程重点实验室，贵州 贵阳 550025)

为了解遵义市霜冻植物上冰核细菌的种类以及筛选对冰核细菌有拮抗作用的细菌，采用小液滴冻结法鉴定冰核细菌的冰核活性，并用双层平板法筛选冰核细菌的拮抗细菌；采用形态学特征、生理生化鉴定以及16S rDNA序列对比分析等方法确定冰核细菌和拮抗细菌种类。结果显示，从遵义市采集到35种植物冻害标本，共分离到4株冰核细菌Z-A、Z-B、Z-C、Z-QCH；从遵义市采集到23种土样，共分离出3株拮抗细菌XH、XM、XL。经鉴定，Z-A、Z-B是菠萝泛菌(Pantoeaananatis)，Z-C是成团泛菌(Pantoeaagglomerans)，Z-QCH是绿黄假单胞(Pseudomonasviridiflava)。拮抗细菌XH、XM是解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)，XL是甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus)。初步了解了遵义市冰核细菌的种类，为遵义市霜冻植物生物防治奠定了一定基础。

冰核细菌； 拮抗细菌； 鉴定； 生物防治

遵义市属亚热带湿润季风气候，冬季无严寒，常伴绵雨，时有凝冻。1月下旬常出现极端寒冷的天气，气温仅有-7.1 ℃。最冷时段常常出现在隆冬1月，并常伴有凝冻发生[1]。遵义市除赤水河谷低热地带无凝冻灾害以外，其余各地都会发生不同程度的凝冻灾害。其中，习水、遵义县为遵义市的重级凝冻区；中部地区的桐梓、两城区(汇川区、红花岗区)、绥阳、湄潭、务川、凤冈为中级凝冻区；正安、道真、仁怀、余庆为轻级凝冻区[2]。

霜冻是一种严重的自然灾害，它能在几小时内毁掉大片农作物[3]和植物，给农业生产造成严重的影响。Maki等[4]首次从赤杨(Alnusjaponica(Thunb.) Steud.)树叶中分离到冰核细菌(ice nucleation active bacteria，INA)，冰核细菌广泛腐生于植物表面，可在-2～-5 ℃诱发植物细胞水结冰而发生霜冻[4]。国内外大量研究证明，在自然界广泛存在着冰核细菌，它是破坏植物的过冷却状态，诱发和加重植物霜冻危害的重要因素[5-10]。因此，防除INA细菌可以减轻和控制霜冻灾害。

本试验从遵义市5个不同县、区，采集植物冻害标本，分离鉴定冰核细菌。并从发生冻害植物的根部采集土壤，从中分离筛选冰核细菌的拮抗细菌。并鉴定冰核细菌及其拮抗细菌的种类，从而确定遵义市冰核细菌的种类及分布情况，初步研究冰核细菌的防治方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标本采集

2014年12月至2015年3月，从遵义市汇川区、红花岗区、习水县、绥阳县、正安县等5个县、区，6个地点采集或征集到35种植物霜冻标本(表1)。

1.1.2 土样采集

从遵义市汇川区植物园和凤凰山2个景点采集发生霜冻的蔬菜、花卉和灌木的根部土壤，用以分离拮抗细菌。

1.1.3 实验用培养基

冰核细菌实验培养基：金氏(KB)培养基[11]。

拮抗细菌实验培养基：牛肉膏蛋白胨(NA)培养基[12]；芽孢杆菌实验培养基：肉汤(LB)培养基[13]。

1.2 分离

1.2.1 冰核细菌的分离

表1 35种植物霜冻标本的采集地点

采集市县区地点寄主植物遵义市汇川区植物园百里香(Thymusmongolicus)、麻叶荨麻(Urticacannabina)、瞿麦(Dianthussuperbus)、小叶黄杨(Buxusmicrophylla)凤凰山假黄杨(Syzygiumbuxifolium)、洒金桃叶珊瑚(AucubajaponicaVariegata)、大黄(Rheumpalmatum)、芹菜(Apiumgraveolens)遵义市红花岗区南宫山湿地公园空心菜(Ipomoeaaquatica)、南瓜(Cucurbitamoschata)、番茄(Lycopersiconesculentum)、花椰菜(Brassicaoleracea)、菊花(Chrysanthemummorifolium)、芭蕉(Musabasjoo)毛冬青(Ilexpubescens)、金银花(Lonicerajaponica)习水县丹霞谷茶树(Camelliasinensis)枇杷(Eriobotryajaponica)、小叶女贞(Ligustrumquihoui)、蟹爪莲(Zygocactustruncatus)、菠菜(Spi⁃naciaoleracea)、青菜(Brassicachinensis)、生菜(Lactucasativa)绥阳县清溪湖景区满天星(Gypsophilapaniculata)、鸢尾(Iristectorum)、马蹄莲(Zantedeschiaaethiopica)、常春藤(Hederanepalensis⁃var．sinen⁃sis)、豌豆(Pisumsativum)蚕豆(Viciafaba)杜英(Elaeocarpussylvestris)正安县九道水森林公园虎眼万年青(OrnithogalumcaudatumAit)、小藜(Chenopodiumserotinum)、老鹳草(GeraniumwilfordiiMaxim)、莴苣(Lactucasativa)

分离冰核细菌采用平板稀释法[14]，按照10倍系列梯度将叶片悬浮液稀释到4个浓度梯度：10-3、10-4、10-5、10-6。取10-5、10-62个稀释度分离细菌，根据不同的菌落形态特征，采用分离培养划线法，挑取不同的单菌落进行划线，分离纯化。

1.2.2 拮抗菌的分离

采用平板稀释法分离拮抗细菌[15]：将土壤悬浮液静置，取上清液稀释到10-3、10-4、10-5、10-64个浓度梯度，取10-5、10-62个稀释度分离细菌。

1.3 冰核活性的测定

采用Vali[16]发明，后又由Lindow[9]改进的小液滴冻结法，进行冰核活性的测定。每个菌株重复3次。将筛选出来的冰核细菌接种到KB斜面上，用冰箱保存菌种。

1.4 冰核细菌拮抗菌的筛选

采用双层平板打孔法[17]筛选冰核细菌的拮抗细菌。并经初筛和复筛筛选出效果明显的拮抗细菌。采用十字交叉法测量抑菌圈的直径。

1.5 鉴定

1.5.1 形态学鉴定与生理生化鉴定

冰核细菌和拮抗细菌的鉴定主要根据《常见细菌系统鉴定手册》[18]《伯杰细菌鉴定手册》第八版[19]的形态特征进行鉴定和分类。

1.5.2 分子鉴定

刮取培养物，使用Biomiga的Bacterial gDNAkit试剂盒(GD2411-01)。按照试剂盒步骤提取DNA，采用通用引物27F和1492R、gyrA-F和gyrA-R(表2)[20]，扩增后采用琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行验证，确定条带正确后，将目的片段纯化回收，并与pMD19-T 载体连接，转化至大肠埃希菌DH5α 感受态细胞，在氨苄抗性平板上进行阳性克隆的筛选，送样测序。

将所测定的序列在GenBank数据库中进行BLAST分析[21]。

采用最大简约法(MP)分析方法对数据进行系统学分析，运用PAUP 4.0 BETA建立系统进化树[22]。拮抗细菌分子鉴定的方法跟冰核细菌的鉴定方法相同，但需加测gyrA基因序列。通过MEGA结合16S与gyrA基因，通过PAUP作MP分析，建立系统发育树。

表2 用于鉴定冰核细菌和拮抗细菌的引物

细菌引物序列冰核细菌、芽孢杆菌27F5′⁃AGAGTTTGATCCTGGCTCAG⁃3′16SrDNA1492R5′⁃GGTACCTTGTTACGACTT⁃3′芽孢杆菌gyrA⁃F5′⁃CAGTCAGGAAATGCGTACGTCCTT⁃3′gyrAgyrA⁃R5′⁃CAAGGTAATGCTCCAGGCATTGCT⁃3′

2 结果与分析

2.1 冰核细菌的分离

从贵州省遵义市5个县、区采集了35种植物冻害标本，并采用平板稀释法分离出387株细菌，采用由Lindow改进的Vali小液滴冻结法鉴定，鉴定出4株冰核细菌，编号为Z-A、Z-B、Z-C和Z-QCH。Z-A的寄主植物是瞿麦(D.superbus)、Z-B的寄主植物是鸢尾(I.tectorum)、Z-C的寄主植物是茶树(C.sinensis)、Z-QCH的寄主植物是芭蕉(M.basjoo)。经小液滴法鉴定：Z-QCH在-5 ℃温度下30 s内有2滴结冰，Z-A在-5 ℃下40 s内有3滴结冰，Z-B和Z-C在-5 ℃下45 s内有2滴结冰。经过鉴定可知，Z-QCH的冰核活性最强，Z-A的冰核活性次之，Z-B和Z-C的冰核活性较弱。

2.2 冰核细菌拮抗菌的筛选

从遵义市汇川区和红花岗区2个地点采集了23份根际土壤，共分离出87株细菌。经过双层平板打孔法，初次筛选出8株对冰核细菌有拮抗作用的菌株。根据8株拮抗细菌的抑菌圈平均直径、增殖速度，复筛出3株强拮抗细菌XH、XM、XL。XH对冰核细菌Z-B的拮抗效果最好，抑菌圈平均直径达19.731 mm；对冰核细菌Z-A的拮抗效果次之，抑菌圈平均直径达11.671 mm；对Z-QCH的拮抗效果最弱，抑菌圈平均直径仅有9.521 mm。XM对冰核细菌Z-QCH的拮抗效果最好，抑菌圈平均直径达20.973 mm；对冰核细菌Z-B的拮抗效果较弱，抑菌圈平均直径达15.093 mm；对Z-C的拮抗效果最弱，抑菌圈平均直径为10.853 mm。XL对冰核细菌Z-A的拮抗效果最好，抑菌圈平均直径达17.563 mm；对冰核细菌Z-C的拮抗效果次之，抑菌圈平均直径达12.873 mm；对Z-B的拮抗效果最弱，抑菌圈平均直径仅有11.151 mm。抑菌效果见图1、图2。

2.3 冰核细菌的鉴定

2.3.1 冰核细菌的形态学鉴定与生理生化鉴定

对4株冰核细菌进行革兰氏染色和镜检，并且做了氧化酶、接触酶和需氧性实验，结果见表3。由以下结果，初步判定这4株冰核细菌为假单胞属(Pseudomonas)和泛菌属(Pantoea)。

2.3.2 16S rDNA序列分析

对4株冰核细菌的16S rDNA片段进行测序，在NCBI上用BLAST 程序与GenBank 中已登录的基因序列进行比对[18]，BLAST结果为：Z-QCH的16S rDNA序列与绿黄假单胞菌(P.viridiflava)有99%的同源性；Z-A、Z-B的16S rDNA序列与菠萝泛菌(P.ananatis)有99%的同源性；Z-C的16S rDNA序列与成团泛菌(P.agglomerans)有99%的同源性。

图1 拮抗细菌XH、XM、XL对冰核细菌Z-B的抑菌效果

图2 拮抗细菌XM对冰核细菌Z-QCH的抑菌效果

表3 4株冰核细菌的形态特征及生理生化反应

项目Z⁃AZ⁃BZ⁃CZ⁃QCH菌落特征圆形、黄色、直杆状、菌落边缘整齐、光滑圆形、浅黄色、直杆状、菌落边缘整齐、光滑圆形、乳黄色、直杆状、菌落边缘整齐、光滑圆形、乳黄色、直杆状、菌落边缘整齐、光滑革兰氏染色G-G-G-G-氧化酶----接触酶++++需氧性实验兼性厌氧兼性厌氧兼性厌氧严格好氧

将4条序列的相关信息提交到GenBank，获得登录号：Z-A：KY604956、Z-B：KY604955、Z-C：KY604954、Z-QBH：KY604957。

使用PAUP(phylogenetic analysis using parsimony)进行最大简约分析，并建立系统发育树(图3、图4)。从系统发育树中看出，Z-A、Z-B与泛菌属的菠萝泛菌(P.ananatis)在一个类群，Z-C与泛菌属的成团泛菌(P.agglomerans)在一个类群。Z-QCH与绿黄假单胞菌(P.viridiflava)在一个类群。根据冰核细菌Z-A、Z-B、Z-C、Z-QCH的菌株形态特征及生理生化反应，并结合16S rDNA的系统发育分析，将Z-A、Z-B鉴定为菠萝泛菌(P.ananatis)，Z-C是成团泛菌(P.agglomerans)，Z-QCH是绿黄假单胞菌(P.viridiflava)。

图3 依据16S rDNA序列构建3株冰核细菌的系统发育树

图4 依据16S rDNA序列构建冰核细菌Z-QCH的系统发育树

2.4 冰核细菌拮抗菌的鉴定

2.4.1 拮抗细菌形态特征和生理生化反应

在油镜下观察，3株拮抗细菌均呈直杆状，两端钝圆，革兰氏染色菌体呈蓝紫色，为革兰氏阳性菌，芽孢染色为蓝绿色，都能产芽孢，芽孢呈卵圆形或椭圆形。菌株XH、XM、XL的生理生化反应见表4。

2.4.2 16S rDNA序列比对

通过16S rDNA序列BLAST比对结果发现，3株细菌与芽孢杆菌16S rDNA的序列同源性都为99%。通过16S rDNA并不能把3株细菌鉴定到种的水平。通过加测gyrA基因，将所得序列BLAST比对结果发现，XH、XM的gyrA基因与解淀粉芽孢杆菌的gyrA基因同源性达99%。

表4 菌株XH、XM、XL的生理生化反应

实验项目XHXLXMVP反应+++MR--+硝酸盐还原+++脂酸---氧化酶---淀粉水解+++接触酶+++

通过测序，分别得到XH、XM的gyrA序列和XL、XM的16S rDNA序列。将序列的相关信息提交到GenBank，获得gyrA序列登录号XH(KY604960)、XM(KY604961)，16S rDNA序列登录号XL(KY604958)、XM(KY604959)，建立系统化发育树(图5)。

图5 依据16S rDNA与gyrA基因序列构建3株拮抗菌的系统发育树

从图5系统发育树中看出，XH、XM离解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)最近，在一个类群，XL与甲基营养型芽孢杆菌(B.methylotrophicus)在一个类群。

根据拮抗菌XH、XM、XL的菌株形态特征及生理生化反应，结合16S rDNA基因分析，将XH、XM鉴定为解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens),XL是甲基营养型芽孢杆菌(B.methylotrophicus)。

3 讨论

本试验从霜冻植物上分离到的4株冰核细菌Z-A、Z-B、Z-C、Z-QCH，分属于3个种，其中Z-QCH是绿黄假单胞菌(P.viridiflava)，Z-A、Z-B是菠萝泛菌(P.ananatis)，Z-C是成团泛菌(P.agglomerans)；可归为假单胞属(Pseudomonas)和泛菌属(Pantoea)2个属，这2个属的冰核细菌都具有很强的冰核活性。本试验从遵义市汇川区凤凰山采集到瞿麦，从遵义市红花岗区南宫湿地公园采集到芭蕉，从习水县丹霞谷采集到茶树，从绥阳县清溪湖景区采集到鸢尾。Z-A的寄主植物是瞿麦，Z-B的寄主植物是鸢尾，Z-C的寄主植物是茶树，Z-QCH的寄主植物是芭蕉。韦建福等[23]在1992—1994年从云南植物上分离到欧文氏菌属(Erwinia)和假单胞菌属(Pseudomonas)2个属的冰核细菌。黄晓琴等[24]在山东茶树上分离到泛菌属(Pantoea)的冰核细菌。本试验在贵州省遵义市分离到假单胞属(Pseudomonas)和泛菌属(Pantoea)的冰核细菌，未分离到欧文氏菌属(Erwinia)的冰核细菌。

从土壤中分离到的3株拮抗菌均为芽孢杆菌属(Bacillus)，将测序结果与GenBank数据库中已知序列进行BLAST分析，发现XH、XM、XL的16S rDNA序列与芽孢杆菌属的基因同源性一致，由于16S rDNA跟生理生化反应并不能将细菌的鉴定准确到种，目前报道的gyrA能区别到种，因此，基于16S rDNA、gyrA基因，以及其生理生化指标，对3个菌株进行鉴定。将XH、XM鉴定为解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)，XL是甲基营养型芽孢杆菌(B.methylotrophicus)。解淀粉芽孢杆菌在其生长过程中可以产生一系列脂肽类物质、聚酮类物质还有具有蛋白活性的抑菌物质，包括表面活性素(surfactin)、伊枯草菌素(iturin)和芬荠素(fengycin)等几大类物质，这些物质对细菌、真菌、病毒和支原体有良好抑制作用[23-24]。本试验从土壤中分离的2株解淀粉芽孢杆菌对冰核细菌有很好的抑制作用。但是，由于微生物的生长繁殖容易受到外界温度的影响，并且，环境中有很多不确定的干扰因素，如雨水会稀释菌液的浓度、大风会加速菌液的蒸发。因此，今后有必要就拮抗菌的抗菌机理以及如何在稀释浓度的情况下保证甚至是提高其拮抗作用进行更深入的研究。

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(责任编辑：张 韵)

2017-02-22

冰核细菌的分离鉴定及其拮抗菌的筛选(贵大人基合字[2013]26号)

赵晨心(1992—)，女，山西高平人，在读硕士研究生，研究方向为植物病害防治，E-mail:1099252966@qq.com。

彭丽娟(1973—)，女，四川合江人，研究生，教授，研究方向为植物真菌及细菌病害防治，E-mail:296430006@qq.com。

10.16178/j.issn.0528-9017.20170530

Q933

A

0528-9017(2017)05-0817-06

文献著录格式：赵晨心，丁海霞，彭丽娟. 遵义市冰核细菌分离鉴定及拮抗细菌筛选[J].浙江农业科学，2017，58(5)：817-822，825.