ε-聚赖氨酸对公猪精液中常见细菌的体外抑制效果研究

谢景兴，刘兆军，魏 宁，侯震坤，杨公社，庞卫军

（西北农林科技大学动物科技学院，陕西 咸阳 712100）

ε-聚赖氨酸对公猪精液中常见细菌的体外抑制效果研究

谢景兴，刘兆军，魏 宁，侯震坤，杨公社，庞卫军

（西北农林科技大学动物科技学院，陕西 咸阳 712100）

试验首先采用高通量测序法检测常温保存 1、3、5 d 关中黑猪精液细菌的种类及所占比例，而后采用 16S rDNA 法初步鉴定精液中分离的部分细菌，并筛选出精液中常见细菌作为 ε-聚赖氨酸体外抑菌试验菌种，最后探究 0、0.01、0.02、0.04、0.08、0.16、0.32 g/L 的 ε-聚赖氨酸对精液中常见细菌的抑制作用。结果表明，在常温保存过程中革兰氏阴性菌为优势菌群，且 0.04 g/L 的 ε-聚赖氨酸能有效抑制大肠杆菌、表皮葡萄球菌和鲁菲不动杆菌的生长。因此，在常温保存过程中添加 ε-聚赖氨酸能有效控制精液中常见细菌的生长。

ε-聚赖氨酸；公猪精液；细菌

公猪精液主要受到动物源和非动物源的细菌污染，动物源的细菌主要来自公猪的粪便、包皮积尿、呼吸道分泌物、生殖道、皮肤和毛发，而非动物源的细菌主要来自污染水源、未灭菌的玻璃器皿、精液稀释设备及采精、精液稀释的工作人员等[1]。近年来在精液中分离到的细菌大约有 25 种左右，其中以肠杆菌科类的细菌居多[1-2]。王健[3]发现公猪精液中主要的细菌有盐单胞菌属、不动杆菌属、葡萄球菌属等。苏泽智[4]研究发现精液中的细菌主要为大肠杆菌、葡萄球菌、变形杆菌等。金穗华等[5]从精液中分离鉴定出 7 种含量较多的细菌，主要为棒状杆菌、金黄色葡萄球菌、不动杆菌属等。张家庆等[6]在广西地区的公猪精液中主要分离到大肠杆菌、克雷伯菌、变形杆菌等。从上述研究结果可知细菌普遍存在于公猪精液中，且不动杆菌属、葡萄球菌、大肠杆菌在以上研究结果中出现频率较大，说明这几种细菌在公猪精液中较常见，可优先作为药敏性试验菌种。

目前主要通过在精液中添加抗生素用以抑制细菌的生长，以延长公猪精液的保存时间。然而，由于抗生素的不合理使用，致使部分细菌对常规抗生素产生耐药性。如今，细菌耐药性问题已成为世界各国不得不面对的公共卫生问题。而畜牧业是抗生素滥用的“重灾区”。为减少抗生素的使用，出现了很多新型抗菌物质。目前，研究较多的是阳离子天然的抗菌剂，如乳酸链球菌素、纳他霉素等。但这些天然抗菌物质对革兰氏阳性菌（G+） 和霉菌的抑制效果较好，而对革兰氏阴性 菌（G-）的抑制效 果不太理想[7]。而污染公猪的细菌主要为 G-菌[8]。因此，应选择对于G-抑菌效果好的抗菌物质。

ε-聚赖氨酸（ε-PL）是一种由 25～35 个相同赖氨酸残基构成的天然阳离子抗菌肽，溶解性大，安全无害，对 G+和 G-菌均有良好的抑制效果[9-10]。其抑菌机理是利用自身携带的正电荷结合到带负电荷的菌体膜上，使菌体膜变成空洞状，从而影响细菌正常的生命活动以实现抑菌作用，当该物质进入人体时能够在相关酶的作用下，转化为人体所必须的赖氨酸[11]。张伟娜[12]发现 ε-PL 能有效抑制食品中常见金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的生长。李宇雄等[13]研究发现ε-PL 能有效抑制人体尿液中常见的细菌（金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、铜绿假单胞菌和大肠杆菌）的生长，其最小抑菌浓度（MIC）为 0.04 g/L。基于以上研究结果，本试验选择从关中黑猪公猪精液中分离的几种细菌和对公猪精子危害最大的大肠杆菌作为ε-PL 体外抑菌试验的菌种，探究不同浓度的 ε-PL对这几种细菌的体外抑制效果，为 ε-PL 在关中黑猪精液常温保存中的添加量提供参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 公猪精液 于 2016 年 9 月 1 日开始采集来源于西北农林科技大学畜牧生产实践基地成年健康关中黑猪公猪的精液用于本试验。徒手采精法采精后，用 BTS 液（葡萄糖：37.15 g；柠檬酸钠：6.00 g；EDTA：1.5 g；碳酸氢钠：1.5 g；KCl：0.75 g） 稀释精液，精液分装，放入保温箱后迅速带回西北农林科技大学动物科技学院脂肪沉积与肌肉发育实验室。

1.1.2 试验菌种 鲁菲不动杆菌、表皮葡萄球菌从公猪稀释精液中分离，大肠杆菌由西北农林科技大学动物科技学院消化道与乳腺生物学实验室惠赠。1.1.3 主要试剂 DP025，台湾捷恩麦克的，细菌基因组 DNA 提取试剂盒（BacteriaGenomicDNAPurification Kit,50r），PCR 扩增试剂 Taq 酶，dNTPs（25mM each），DNAmaker（DL 2 000），ε-多聚赖氨酸（95%国产分析纯）由上海源叶生物科技有限公司生产，草酸铵结晶紫染色液，由索莱宝生物科技有限公司生产。

1.1.4 主要仪器 无菌操作台，PCR 仪，离心机，CASA（精子计算机辅助分析仪），光学显微镜，37 ℃摇床培养箱，紫外分光光度计。

1.2 试验方法

1.2.1 不同保存时间段精液中微生物的测定 将用BTS 稀释后常温保存 1、3、5 d 的关中黑猪公猪精液送北京诺禾致源科技股份有限公司进行高通量测序。检测不同保存时间段的关中黑猪公猪精液中的菌属，及各个菌属所占的比例。

1.2.2 精液中病原细菌的分离 在无菌操作台内，取 BTS 液稀释的公猪精液 10 μL 均匀涂抹于固体培养基表面。放入 37 ℃培养箱中，37 ℃培养 12 h后，挑取形态不同的单个菌落于 10mL 装有液态培养基离心管中，将离心管放入 37℃摇床培养箱内，37 ℃摇床培养 24 h。

1.2.3 细菌的保种及革兰氏染色

（1）保种。

在无菌操作台内分别取 800 μL 菌液与 400 μL甘油于冷冻管内均匀混合后，将冷冻管存放于-80 ℃冰箱内保存以供需要时使用。

（2）革兰氏染色。

按试剂盒使用说明操作。

1.2.4 16S rDNA 的克隆及序列测定 将菌液提取染色体 DNA，用引物 AD007 和 AD008 进行 PCR 扩增，扩增体系 50 μL：上游引物 2 μL（10mmol），下游引 物 2 μL（10 mmol），模 版 1 μL（约 50 ng），2 ×Taq PCRMastermix 25 μL，超纯水 20 μL。扩增条件：94 ℃，5min；94 ℃，30 s；54 ℃，30 s；72 ℃，90 s；重复 2～4步骤，进行 29 个循环；72 ℃，10min。将扩增产物在1%琼脂糖凝胶中电泳鉴定，以引物 AD007 和AD008 进行测序（表 1）。将测序所得序列输入 NCBI数据库比对。选择同源性高的细菌，使用 MEGA 7.0构建进化树，初步鉴定该细菌的菌属。

表1 引物序列

1.2.5 比浊法测定 ε-聚赖氨酸的最小抑菌浓度 取0.1 g ε-PL 溶解于 1mL 的无菌水中，然后从中分别吸取 0、1、2、4、8、16、32 μL 的 ε-PL 于 10mL 的离心管中，除添加 32 μL ε-PL 外的离心管其余的 6 个管均用无菌水稀释至 32 μL。而后用液体 LB 培养基稀释至 10mL，配制成含有 0、0.02、0.04、0.08、0.16、0.32g/L ε-PL 的液体培养基。然后在每个离心管内添加10 μL 的菌液，在 17 ℃恒温箱内培养 5 d 后，用紫外分光光度计在 620 nm 处测量其吸光值（OD620nm）。

2 结果与分析

2.1 公猪精液常温保存 1、3、5 d 后公猪精液中不同细菌所占比例

在常温保存第1天精液中主要的细菌以葡萄球菌科占 24.13%、链球菌科占 13.39%、气球菌科占11.84%等革兰氏阳性菌为主。而革兰氏阴性菌中的肠杆菌科占 17.19%、盐单胞菌科占 3.95%、拟杆菌占 4.71%。当保存至第 3 天时，细菌所占的比例发生变化。在这个时间段 G-所占的比例升高，其中主要是肠杆菌科上升至 30.82%，而 G+所占的比例下降。当保存至第 5 天时精液中绝大部分的细菌为 G-中的肠杆菌科细菌，比例达到 97.76%，而 G+仅占很少的一部分。说明在 17 ℃常温保存件下，革兰氏阴性菌为优势菌群。

2.2 精液中分离细菌的初步鉴定

将测序所得序列输入 NCBI比对，得到不同来源的已鉴定细菌的 16SrDNA 序列，其中各个 16SrDNA序列与测序所得的序列的一致性 （identity） 均在99%以上，而目前 16S rDNA 的碱基序列的相似性已成为划分菌属的标准，其中属内相似性应大于95%。而后使用 MEGA 7.0 软件构建进化树，其同一分支上的置信度都在 70 以上，一般而言置信度值在70 以上较为可信[14]。本试验结果表明分离细菌样本D 1.3 与鲁菲不动杆菌的序列一致性为 99%，构建进化树后其聚于同一分支下且置信度为 100，显微镜检细菌形状为球状或杆状，革兰氏染色呈红色，综上所述 D 1.3 初步鉴定为鲁菲不动杆菌。样本 D 1.2与表皮葡萄球菌同聚一分支，且两者的序列一致性为 99%，置信度为 99，显微镜检细菌形状为葡萄球状，革兰氏染色呈蓝紫色。

2.3 ε-聚赖氨酸（ε-PL）的最小抑菌浓度（MIC）测定

OD620nm值越大说明液体 LB 培养基中细菌数量越多，0.01 g/L ε-PL 对细菌几乎没有抑菌效果，各细菌在该浓度下的吸光值接近于或稍微高于未添加ε-PL 组。随着 ε-PL 浓度的增大，大肠杆菌、表皮葡萄球菌在 ε-PL 的浓度为 0.02 g/L 时 OD620nm急剧下降，说明该浓度的 ε-PL 已经起到抑菌效果，初步估计 0.02g/L ε-PL 为大肠杆菌和表皮葡萄球菌的最小抑菌浓度。而在该浓度下鲁菲不动杆菌的吸光值接近于对照组，说明 0.02 g/L ε-PL 对该细菌没有抑制效果。当ε-PL 浓度为 0.04 g/L 时，OD620nm急剧下降，说明该浓度对鲁菲不动杆菌已经起到抑制效果。初步估计0.04 g/L 为鲁菲不动杆菌的最小抑菌浓度。

3 讨论

本试验采用高通量测序法对不同常温保存时间段关中黑猪精液细菌检测发现，在常温保存第1天，精液中的细菌主要为 G+菌，G-菌仅占较少的一部分。但随着保存时间的增加精液中的细菌占有发生了很大的变化。保存至第5天时公猪精液中绝大部分细菌为肠杆菌科细菌 （97.76%），G+菌占极少部分。王健[3]研究发现在精液的常温保存初期（1～2 d）细菌生长缓慢，当精液保存至第3天时细菌开始呈指数的增长。当保存至第 5 天时，由于营养物质的减少细菌的生长速度放缓。因此，我们可以初步认为在精液保存的第1天后的精液中的细菌接近于原精中的细菌含量。这与王健[3]对原精中细菌高通量测序结果有所区别，这可能是由于公猪饲养环境、采精过程和精液稀释及常温保存环境不一样所导致的。因此，应严格按采精程序采精，尽量避免在采精过程中引入细菌。而保存至第 5 天时，精液中的细菌主要为 G-中的肠杆菌科细菌，说明这类细菌在公猪精液常温保存环境下为优势菌群，在选择抗菌药物时应选择对 G-菌有抑制效果的药物。

大肠杆菌利用自身的结构特性结合到人精子膜的表面，损伤精子膜的表面从而降低精子活力和活率[15-16]。还有研究表明大肠杆菌还会黏附到精子的表面，损伤精子顶 体 和 质 膜[17]。本 试 验 发 现 ε-PL 在0.02 g/L 时就能够有效抑制精液中常见的表皮葡萄球菌和大肠杆菌的生长，但在该浓度下对鲁菲不动杆菌的抑制效果不明显，甚至有一定的促生长作用。需添加到 0.04 g/L 的浓度时才能对这种细菌起到抑菌效果。张伟娜[12]研究发现 ε-PL 是一种广谱抑菌剂，该抗菌物质对细菌的抑制效果较好。这与本试验的结果相似。而最小抑菌浓度有所不同，这可能是由于 ε-PL 的生产厂家、纯度以及细菌的菌种不同所导致的。

4 结论

当关中黑猪精液保存至第1天时，精液中革兰氏阳性菌占较大的比例，随着保存时间的增加，至第5天时革兰氏阴性菌占绝大部分。因此在实践生产中应选择对革兰氏阴性菌抑制效果好的抗菌药物用以精液的常温保存。0.04 g/L 的 ε-PL 能够有效抑制大肠杆菌、鲁菲不动杆菌和表皮葡萄球菌的生长。

[1] Althouse GC,Lu KG.Theriogenology[J],2005,63(2):573-584.

[2] Althouse G C,Kuster C E,Clark SG,et al.Theriogenology[J], 2000,53(5):1167-1176.

[3] 王健. 蛋氨酸碘对猪精液常温保存效果的研究[D]. 西安：西北农林科技大学，2016.

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（编辑：郭玉翠）

Inhibitory Effect of ε-polylysine on Common Bacteria of Boar Semen in Vitro

XIE Jingxing,LIU Zhaojun,WEINing,HOU Zhenkun,YANG Gongshe,PANGWeijun
(College of Animal Science and Technology,Northwest A&FUniversity,Xianyang 712100,China)

The experimentwas conducted to explore the inhibitory effect of ε-polylysine on common bacteria in semen and to provide new ideas for reducing the use of antibiotics in dilutions.First,the high-throughput sequencing method was used to detect the species and proportion of semen bacteria in the black boar at room temperature for 1,3,5 days.Then,16S rDNA method was used to identify some bacteria isolated from semen and the bacteria ε-polylysine in vitro,and finally explored 0 g/L,0.01 g/L,0.02 g/L,0.04 g/L,0.08 g/L,0.16 g/L, 0.32 g/L ε-polylysine inhibits common bacteria in semen.The results showed that Gram-negative bacteria were the dominant flora during the preservation of normal temperature,and 0.04 g/L ε-polylysine could inhibit the growth of Escherichia coli,Staphylococcus epidermidis and Acinetobacter lwoffi.Therefore,the addition of εpolylysine during the preservation of the room temperature can effectively control the growth of common bacteria in semen.

ε-polylysine;semen;bacteria

S828.3

A

1002-1957(2017)03-0051-03

2017-04-24 收稿，2017-05-08 修回

国家生猪产业技术体系（CARS-36）；西北农林科技大学试验示范站（基地）科技成果推广项目（TGZX2015-18）

谢景兴（1991-），男，福建龙岩人，在读硕士研究生，主要从事动物遗传育种与繁殖研究工作.E-mail：xjx8513@nwsuaf.edu.cn通讯作者：庞卫军（1972-），教授，博士生导师，研究方向为肌肉生物学与猪遗传改良.E-mail：pwj1226@nwafu.edu.cn