金黄色葡萄球菌噬菌体效价测定方法的建立

魏东，谢安平，陈成，王国治

金黄色葡萄球菌噬菌体效价测定方法的建立

魏东，谢安平，陈成，王国治

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是引起人类及动物化脓性感染的常见致病细菌，是引起烧伤患者创面感染的主要病原体。对于金黄色葡萄球菌感染的治疗药物，人们一直在努力探索。自从 1928 年 Fleming 发现青霉素，20 世纪 40 年代用于治疗金黄色葡萄球菌后不久，即出现耐青霉素的金黄色葡萄球菌。20 世纪 50 年代，Beecham发现了耐青霉素酶的 β-内酰胺类药物甲氧西林，但仅仅几年后，耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌（methicillin-resistan Staphylococcus aureus，MRSA）就相继在欧洲和美国出现[1]。20 世纪 80 年代以后，MRSA 感染呈现上升趋势，甚至引起医院的暴发流行[2-3]。万古霉素曾被誉为抗感染治疗领域的“最后一道防线”，但从 1996 年至今，全球范围内已报道多例对万古霉素耐药的病例，引起医学界的高度重视[4-5]。目前，需要一种不同于抗生素的新型金黄色葡萄球菌感染治疗方法。

与传统治疗方法相比，噬菌体治疗可避免抗生素的副作用及过敏反应[6-7]。随着 MRSA 等耐药菌在医院和社区的流行传播，噬菌体的药用价值再次受到人们的重视，将噬菌体的临床研究带入了一个新的阶段[8]。对于金黄色葡萄球菌的噬菌体类治疗用生物制品，其效价直接影响着制品的有效性。为此，本研究建立了金黄色葡萄球菌噬菌体效价的测定方法，为噬菌体制剂的质量控制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要材料

1.1.1 噬菌体及菌种 金黄色葡萄球菌（编号：CMCC(B) 26554）、金黄色葡萄球菌噬菌体（编号：CMCC(B)26554-P1）为中国食品药品检定研究院保存。

1.1.2 主要试剂 营养琼脂培养基、脑心琼脂培养基由中国食品药品检定研究院培养基室提供；标准细菌比浊管由中国食品药品检定研究院提供；氯化钠（NaCl）、氯化钙（CaCl2）、三羟甲基氨基甲烷（Tris-HCl）、明胶购于国药集团化学试剂有限公司；硫酸镁（MgSO4·7H2O）购于上海美兴化工有限公司。

1.1.3 实验仪器 DH6000AB 培养箱购自天津市泰斯特仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 单层琼脂培养法与双层琼脂培养法的比较 单层琼脂培养法，取 100 μl 金黄色葡萄球菌菌液与 100 μl 适当稀释度的噬菌体混合，室温吸附，混合液中加入 10 ml 营养琼脂培养基（含 0.75% 琼脂），混匀后倾注平皿，每个稀释度设 3 个重复，同时以宿主菌作对照。待琼脂凝固后置37 ℃ 培养 16 ～ 24 h 后计数空斑，计算噬菌体原液效价，即 1 ml 原液样品中所含侵染性噬菌体的粒子数。噬菌体效价（pfu/ml）= 噬菌斑平均数 × 稀释倍数。

双层琼脂培养的下层为营养琼脂（含 1.5% 琼脂），取100 μl 金黄色葡萄球菌菌液与 100 μl 适当稀释度的噬菌体混合，室温吸附，混合液中加入 3 ml 营养琼脂培养基（含0.5% 琼脂），混匀后将其均匀铺满下层营养琼脂平板表面，培养及计数同单层琼脂培养法。

1.2.2 培养基中氯化钙浓度对噬菌体效价的影响 采用双层琼脂培养法，一种体系的培养基中不含 CaCl2，另一种体系的培养基铺板之前加入 1 mol/L 的 CaCl2溶液（终浓度为 400 μg/ml），比较两种体系中氯化钙对噬菌体效价的影响。

1.2.3 培养基的选择 采用双层琼脂培养法，一种体系使用营养琼脂培养基，另一种体系使用脑心琼脂培养基，比较两种培养基体系对噬菌体效价测定结果的影响。

1.2.4 菌液浓度的选择 采用双层营养琼脂培养法，将金黄色葡萄球菌菌液稀释成 5 × 109、1.5 × 109、5 × 108及1.5 × 108/ml 浓度，分别与适当稀释的噬菌体混合后，测定噬菌体效价。

1.2.5 吸附时间的选择 采用双层营养琼脂培养法，将金黄色葡萄球菌菌液稀释成 5 × 108/ml，与适当稀释的噬菌体混合，分别于室温吸附 0、15 及 30 min 后，测定噬菌体效价。

1.3 统计学处理

采用 Minitab 16 统计软件，将噬菌体效价取以 10 为底的对数后进行 t 检验，以 P ＜ 0.05 视为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 单层琼脂培养法与双层琼脂培养法的比较

单层琼脂培养法测定的噬菌体原液效价均值为 5.5 ×107pfu/ml，双层琼脂培养法测定的噬菌体原液效价均值为2.6 × 108pfu/ml，双层琼脂培养法的测定结果高于单层琼脂培养法，差异有统计学意义（P ＜ 0.001），见图 1。因此，选择双层琼脂培养法进行噬菌体效价测定。

2.2 培养基中氯化钙浓度对噬菌体效价的影响

不含 CaCl2培养基所测定的噬菌体效价的对数均值为（8.42 ± 0.02）与含 CaCl2培养基结果（8.37 ± 0.12）接近，差异无统计学意义（P = 0.535）。因此，选择不含 CaCl2的培养基进行噬菌体效价测定。

2.3 培养基的选择

使用营养琼脂培养基测定的噬菌体效价的对数均值结果为（8.42 ± 0.02）与脑心琼脂培养基结果（8.37 ± 0.08）基本一致，差异无统计学意义（P = 0.397）。因此，选择较为经济的营养琼脂培养基进行噬菌体效价测定。

2.4 菌液浓度的选择

噬菌体分别与 4 种浓度的金黄色葡萄球菌菌液混合所测定的效价结果基本一致，任何浓度组之间差异均无统计学意义（P ＞ 0.05），见图 2。菌液浓度过高时，所形成的噬菌斑较小，菌液浓度过低时，背景颜色过浅，均不便于观察计数。菌液浓度为 5 × 108/ml 时，噬菌斑大小及背景颜色均适于计数。因此，选择菌液浓度为 5 × 108/ml。

图 1 单层琼脂培养法与双层琼脂培养法效价测定结果比较（***P ＜ 0.001）

图 2 菌液浓度对噬菌体效价的影响

2.5 吸附时间的选择

结果显示，吸附 0、15 及 30 min，所测得的效价结果差异无显著意义，见表 1。因此，选择中间时间点，确定吸附时间为 15 min。

表 1 不同吸附时间对噬菌体效价的影响

3 讨论

噬菌体是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的细菌病毒的总称，具有抗感染治疗的天生潜质。噬菌体有溶菌作用和严格的种型特异性，可利用噬菌体作细菌的鉴定和分型，亦可用于防治某些传染病[9]，特别是在耐药细菌感染治疗方面具有广阔前景[10-11]。

本研究选取一株具有广谱裂解特性的金黄色葡萄球菌噬菌体，建立噬菌体效价测定的标准化方法。首先，比较了单层琼脂培养法与双层琼脂培养法对噬菌体效价测定结果的影响。单层琼脂培养法具有操作简便的特点[12]，但试验结果表明，单层琼脂培养法测定结果明显低于双层琼脂培养法。因此，选择双层琼脂培养法进行金黄色葡萄球菌噬菌体效价测定。氯化钙有增加细胞膜通透性的作用，有些噬菌体在制备过程及效价测定时均需要添加氯化钙，但本研究中氯化钙对所选取噬菌体株的效价测定无任何影响。本文还分析了可能影响噬菌体效价测定的其他因素，结果显示培养基种类、菌液浓度以及吸附时间对噬菌体效价无明显影响。

本文建立了金黄色葡萄球菌噬菌体效价的测定方法，为金黄色葡萄球菌噬菌体相关生物制品的质量控制奠定了基础。

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我会常务理事谢恬教授获何梁何利基金科学与技术创新奖

我会常务理事谢恬教授获得 2016 年度何梁何利基金科学与技术创新奖。这也是我国中医学、中西医结合学界在此次颁奖大会上唯一的获奖者。

何梁何利基金由香港爱国金融家何善衡、梁銶琚、何添、利国伟于 1994 年创立，旨在奖励中国杰出科学家，促进科学技术进步与创新，下设科学与技术成就奖、科学与技术进步奖和科学与技术创新奖，有“中国的诺贝尔奖”之称。20 多年来，何梁何利基金共表彰了 1147 位杰出科技工作者，以其公正性和权威性成为社会力量设立科技奖的杰出代表，中青年人才和海外归国人员成为创新主要力量。

谢恬教授团队研发成功具有自主知识产权的中西医结合抗癌新药榄香烯脂质体以及濒危珍稀中药材石斛人工繁育栽培技术，并实现产业化推广。该团队设计建成全球首条脂质体靶向制剂产业化生产线，首次把第四代药物制剂的代表脂质体运用于中药并成功产业化。评委会认为，“谢恬教授团队取得了具有原创性的重大研究成果”，“对医药产业及中医、中西医结合创新发展具有重要意义。”

据了解，榄香烯脂质体正式投产后已使国内外 70 多万癌症患者受益，目前平均每年国内有 3 万名左右患者使用该药。中国医学科学院肿瘤医院、中国中医科学院广安门医院、首都医科大学北京中医院等国内多家肿瘤医院已通过临床研究证明，榄香烯脂质体的疗效不亚于化疗，而且没有化疗药的毒副作用。

2013 年，榄香烯脂质体荣获中国优秀发明专利奖，谢恬教授团队还历经 8 年多时间在美国、英国、法国、德国、荷兰、意大利等欧美国家成功获得了榄香烯脂质体发明专利。接下来，他们还准备在这些国家做研究注册新药，造福全世界更多癌症患者。（信息来源：杭州师范大学）

10.3969/j.issn.1673-713X.2017.03.014

100050 北京，中国食品药品检定研究院结核病疫苗室/卫生部生物技术检定方法及其标准化重点实验室

王国治，Email：vaccine2012@126.com

2017-03-07