桃仁、红花对UUO大鼠肾组织ILK、E-cad、FN和α-SMA表达的影响

李小波，彭榜亚，杨江权，陈 阳

(1.遵义医学院珠海校区 诊断学教研室，广东 珠海 519000；2.遵义医学院 生物化学和分子生物学教研室，贵州 遵义 563099；3.遵义医学院珠海校区 药学教研室，广东 珠海 519000)

基础医学研究

桃仁、红花对UUO大鼠肾组织ILK、E-cad、FN和α-SMA表达的影响

李小波1，彭榜亚2，杨江权2，陈 阳3

(1.遵义医学院珠海校区 诊断学教研室，广东 珠海 519000；2.遵义医学院 生物化学和分子生物学教研室，贵州 遵义 563099；3.遵义医学院珠海校区 药学教研室，广东 珠海 519000)

目的 探讨桃仁、红花及其药对对单侧输尿管梗阻(UUO)大鼠肾组织ILK、FN、α-SMA及E-cadherin表达的影响。方法 健康SD大鼠随机分为5组，每组6只，除正常组外，其余大鼠行单侧输尿管梗阻手术。正常组、模型组给予2 mL蒸馏水灌喂，桃仁组、红花组、桃仁+红花组分别给予6 g/(kg·d)的灌喂量。连续灌喂14 d后处死大鼠，取出手术侧肾脏，HE染色观察肾脏病理变化，qPCR和western blot检测肾组织中整合素连接激酶(integrin-linked kinase，ILK)、纤维连接蛋白(fibronectin，FN)、α-平滑肌激动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)及E-钙黏蛋白(E-cadherin，E-cad)基因和蛋白表达。结果 肾脏组织形态学观察显示，与正常组相比，模型组大鼠梗阻侧肾脏，肾间质表现出明显肿胀，纤维化程度重；模型组的E-cad表达降低，ILK、FN及α-SMA的表达升高(P<0.05)；与模型组相比，各治疗组的肾脏病理改变减轻，E-cad表达升高(P<0.05)，ILK、FN及α-SMA的表达降低(P<0.05)；且以桃仁+红花组的效果更佳。结论 桃仁、红花及其药对可通过升高E-cadherin和降低ILK、FN及α-SMA的表达来减缓肾间质纤维化，以桃仁-红花药对的效果更好。

桃仁；红花；单侧输尿管梗阻；整合素连接激酶

肾间质纤维化(renal interstitial fibrosis，RIF)是所有慢性肾脏疾病进展为慢性肾衰竭的共同通路和病理改变，其主要病理表现成纤维细胞增殖造成的大量基质蛋白积聚。肾小管上皮-间质转化(epithelial mesenchymal transition，EMT)是RIF的关键机制，即肾小管上皮细胞激活成为具有分泌和收缩能力的肌成纤维细胞(myofibroblast，MyoF)，MyoF分泌大量的胶原沉积于肾间质，导致纤维化的发生。钙依赖性跨膜糖蛋白(E-cadherin，E-cad)是上皮细胞标志物，在肾小管上皮细胞转分化过程中，主要就是E-cad代表的肾小管上皮细胞减少，而α-平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth muscle actin，α-SMA)标志的间质细胞增加[1]。整合素连接激酶(integrin linked kinase，ILK)是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，不仅可加强整合素与纤维连接蛋白(Fibronectin，FN)的结合，调节由整合素介导的FN等细胞外基质(extracellular matrixc，ECM)的聚集，而且对肾小管上皮细胞EMT起着重要调节作用[2-3]。

桃仁-红花药对是传统的活血化瘀药物，研究表明桃仁、红花可以延缓多脏器纤维化[4-6]，但是两者相须配伍是否可以加强这种作用，鲜有报道，本实验以单侧输尿管梗阻(UUO)大鼠为研究对象，观察桃仁、红花及其药对对UUO模型大鼠肾组织ILK、E-cadherin、FN、α-SMA表达的影响，进一步揭示桃仁、红花及其药对抗肾纤维化的作用机制是否与ILK诱导的EMT有关。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康清洁级雄性SD大鼠，10～12周龄，体重(200±20) g；购于广东省医学实验动物中心，许可证号：XK粤2013-0046。大鼠自由进食和饮水，温度(23±2)℃，湿度控制在40%～70%，采用交替灯光照射12 h，每笼子饲养6只。

1.2 药物与试剂 桃仁、红花颗粒剂购于江阴天江药业有限公司(产品批号：1307092、1207072)。Prime Script RT reagent kit和SYBR Premix EX Taq Ⅱ购自大连宝生物有限公司，批号为RR047A和RR820A; BCA蛋白定量试剂盒购自上海碧云天公司。兔抗大鼠ILK、E-cadherin、FN和α-SMA抗体购自武汉天鹰试剂公司，批号分别为：12955、20874、15613和14395。

1.3 仪器 奥林巴斯生物显微镜BX-43(日本OLYMPUS公司)，PCR扩增仪7500(美国ABI公司)。

1.4 方法

1.4.1 UUO模型的制备 用戊巴比妥钠麻醉大鼠，脊背部左肋脊角处做一纵行切口，分离出输尿管并且结扎，即为单侧输尿管梗阻动物模型。

1.4.2 动物分组及实验 30只大鼠适应性喂养1周后随机分组：正常组、模型组、桃仁组、红花组和桃仁+红花组，每组6只。正常组、模型组于每日灌喂2 mL蒸馏水1次，桃仁组、红花组、桃仁+红花组(桃仁、红花比例为1∶1)按6 g/(kg·d)日将颗粒药稀释成2 mL，一次灌胃，手术次日开始灌喂，连续灌喂14 d，处死大鼠，取出肾脏。一部分肾脏用作HE染色切片观察，一部分用作qPCR和Western blot检测。

1.4.3 形态学观察及检测方法

1.4.3.1 HE病理切片观察 取出肾脏用4%多聚甲醛溶液固定，石蜡包埋并切片，将组织切片按常规方法进行HE染色，光镜观察肾小球、肾小管和间质的病理变化。显微镜400倍下连续记录不重叠10个视野的数值，小管间质损害的特征按Banff分级进行0～3+半定量计分：无变化评0分，轻度改变评1分(病变范围<25%)；中度评2分(病变范围26%～50%)；严重评3分(病变范围>50%)[7]。

1.4.3.2 qPCR检测ILK、FN、α-SMA及E-cadherin的基因表达 取80 mg肾组织用TRIzon法提取总RNA，按照试剂盒说明书进行cDNA 合成，作为模板，引物序列见表1，进行real-time PCR反应，反应体积为20 μL:cDNA 2.0 μL，上、下游引物各0.8 μL，2× SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，ddH2O 6.4 μL。反应条件为第一步预变性：95 ℃，30 s，1个循环；第二步PCR反应：95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40个循环。结果使用Bio-Rad CFX Manager荧光定量软件进行分析用公式2-△△Ct方法。

表1 引物序列

基因序列(5'-3')ILKForward:TTTTGCCGTGCTTCTGTGGReverse:CGTGGGGGGAAATACCTGE-cadherinForward:AGGTCGGTGCCCGTATTGReverse:TGGTCTTGGGGTCTGTGATGFNForward:GTTGGTTGCCCTGTTCTGCReverse:GGCTACCTGTGTTTCCCTTTGα-SMAForward:CTGAACCCTAAGGCCAACCGReverse:CTCCAGAGTCCAGCACAATACCGADPHForward:CATCAACGACCCCTTCATTGReverse:GAAGATGGTGATGGGTTTCC

1.4.3.3 Western blot 取80 mg大鼠肾脏组织加入1 mL裂解液，12 000 rmp离心10 min，取上清，根据BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，加20 μL蛋白上样在10% SDS-PAGE中电泳，湿转法将蛋白转移至PVDF膜，将膜浸在封闭液中低速摇匀封闭2 h，将膜取出直接放入一抗中，4 ℃封闭过夜；PBST洗膜，5 min×10次；将膜转入二抗中，室温，孵育1～2 h；PBST洗膜， 5 min×10次；用化学发光法(ECL)显影。

2 结果

2.1 大鼠肾脏形态学及病理切片观察 正常组肾脏未见病理改变，模型组肾小管上皮细胞大量萎缩、变性，间质内大量炎性细胞浸润，呈现明显的间质纤维化。与正常组比较，模型组HE评分明显升高 (P<0.05) ，说明造模成功，大鼠肾脏出现肾间质纤维化改变。与模型组比较，各治疗组HE评分明显降低 (P<0.05)，说明桃仁、红花对肾间质纤维有确切的防治作用。并且以桃仁、红花药对治疗组效果最佳，说明联合使用较单独使用效果更佳(见图1和表2)。

A：正常组；B：模型组；C：桃仁组；D：红花组；E：桃仁+红花药对组。图1 大鼠肾脏病理切片观察(HE，×400)

组别肾间质损伤评分正常0.06±0.03模型2.82±0.43#桃仁2.34±0.45*红花2.32±0.33*桃仁+红花1.91±0.32*

与正常组比较，#P<0.05；与模型组比较，*P<0.05。

2.2 桃仁、红花及其药对调节ILK、FN、α-SMA及E-cadherin基因表达 与正常组相比，模型组的ILK、FN、α-SMA的表达较高(P<0.05)，E-cadherin的表达较低(P<0.05)；与模型组相比较，各治疗组的ILK、FN、α-SMA的表达下降(P<0.05)，E-cadherin的表达上升(P<0.05，见图2)。

与正常组比较，#P<0.05；与模型组比较， *P<0.05。 图2 桃仁、红花调节ILK、FN、α-SMA及E-cadherin基因表达

2.3 桃仁、红花及其药对调节ILK、FN、α-SMA及E-cadherin蛋白表达 与空白组比较，模型组大鼠肾组织ILK、FN、α-SMA蛋白表达均明显上升(P<0.05)，E-cadherin蛋白表达明显下降(P<0.05)。与模型组相比，各治疗组下调ILK、FN、α-SMA蛋白表达，升高E-cadherin蛋白表达(P<0.05)。但桃仁-红花药对效果更好(见图3和图4)。

与正常组比较，#P<0.05；与模型组比较，*P<0.05。 图3 桃仁、红花调节ILK、FN、α-SMA、E-cadherin蛋白表达

图4 Western blot检测蛋白表达条带图

3 讨论

方剂配伍讲究君臣佐使，整合多种药物针对病变发挥出更加全面而副作用小的疗效，相比单味中药，方剂中的药物不仅仅是简单的叠加，而是发生了复杂的效应。深入研究方剂配伍是中医发展的关键问题之一，探明中医方剂的配伍疗效机制，有利于中医药走向世界，更好地为患者服务。药对是中医临床常用的相对固定的两味中药的配伍组合，是中药配伍的基本形式，传统中医认为两味中药配伍可相须、相对、相使，但是缺乏现代医学的理论研究。桃仁-红花是相须配伍，用于治疗血瘀证，可活血化瘀，传统医学认为两者同时应用于患者，可以加强治疗的效果。李均等[8-9]观察了桃仁对UUO模型大鼠的影响，发现桃仁可以减轻炎性浸润，减缓纤维化，减少结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF)、转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)表达，提示桃仁可以降低TGF-β、CTGF的过度表达，减缓肾间质纤维化病程进展。许庆友等[10-11]观察红花对UUO模型大鼠肾间质纤维的影响，发现红花明显抑制肾小管上皮细胞增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)、α-SMA和Ⅲ型胶原(collagen-Ⅲ，Col-Ⅲ)的表达，从而有效缓解肾间质的纤维化。孙时华等[12]运用红花的主要有效成分红花黄色素对UUO大鼠模型进行干预治疗，发现红花黄色素可降低肾间质中FN和Ⅰ型胶原(collagen-Ⅰ Col-Ⅰ)蛋白的表达，抑制细胞外基质在肾间质的堆积，延缓肾小管损伤及肾纤维化的进展。在临床使用中，桃仁、红花经常是以药对的形式出现在复方中，但已有研究并没有涉及到两者联合使用效果较单独使用是否有加强。ILK作为TGF-β下游重要的效应物，可诱导肾小管上皮细胞转分化，促进细胞外基质的沉积[13]。桃仁、红花及其药对是否通过减少ILK表达，而抑制肾小管上皮细胞转分化，延缓肾小管间质纤维化的进展，尚无报道。

本研究结果显示，UUO造模后第14日，正常组大鼠ILK、α-SMA和FN在肾组织无或仅微量表达，E-cad表达显著，而模型组大鼠ILK、α-SMA和FN表达增高，E-cad表达降低，说明模型组出现了明显的肾小管上皮细胞转分化，ILK可能参与了梗阻性肾间质纤维化的发生。而桃仁、红花组能有效降低ILK、α-SMA和FN在肾小管上皮细胞和间质中的表达，提高E-cad的表达。说明桃仁、红花可能是通过抑制ILK的表达，保护肾小管上皮细胞，防止其转分化，从而减少肌成纤维细胞的生成，减低细胞外基质的聚集。各治疗组均能降低ILK、α-SMA、FN的表达，升高E-cad表达，但未能到正常组的水平，说明桃仁、红花及其药对只能延缓疾病的发展，并不能完全阻止RIF的发生发展；研究显示桃仁-红花药对较单个药物能够更好延缓肾间质纤维化，说明桃仁-红花药对相须配伍有利于药效的发挥。药对作用的机制研究为进一步研究其在复方中的作用奠定基础，有助于我们继续探讨桃仁-红花药对在临床慢性肾脏疾病的治疗作用。

综上所述，桃仁、红花及其药对能降低ILK、FN、α-SMA的表达，升高E-cadherin的表达，可能是其延缓肾间质纤维化进展的作用机制。本研究为中医药防治慢性肾功能衰竭提供了新的思路；并且通过对桃仁-红花药对的研究，为中药组方提供依据，为进一步研究相关复方的作用机制奠定基础。

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[收稿2017-01-05;修回2017-03-10]

(编辑：王静)

Effects of Persicae Semen and safflower on the expressions of ILK,E-cad,FN and α-SMA in the renal tissue of unilateral ureteral obstruction rats

LiXiaobo1,PengBangya2,YangJiangquan2,ChenYang3

(1.Department of Diagnostics,Zhuhai Campus of Zunyi Medical University,Zhuhai Guangdong 519000,China; 2.Department of Biochemistry and Molecular Biology,Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China; 3.Department of Pharmacy,Zhuhai Campus of Zunyi Medical University,Zhuhai Guangdong 519000,China)

Objective To investigate the effects of Persicae Semen and safflower on the expressions of integrin-linked kinase (ILK),fibronectin (FN),α- smooth muscle actin (α-SMA) and E-cadherin (E-cad) mRNA and protein in renal interstitial fibrosis (RIF) of obstructed kidneys in a unilateral ureteral obstruction (UUO) rat model.Methods Thirty SD rats were randomly divided into 5 groups:normal group,model group,Persicae Semen group,safflower group,Persicae Semen & safflower group.Normal and model groups were gavaged with steamed water and other treated groups were gavaged with relevant drugs.Rats were sacrificed and the specimens were collected on 14 d after UUO.HE staining was used to observe the pathological changes.ILK,E-cad,FN and α-SMA expressions were measured by qPCR and western blot analysis.Results The most obvious pathological changes were shown in the model group and Persicae Semen + safflower attenuated these pathological changes.Compared with the nomal group,the expressions of ILK,FN,and α-SMA were significantly increased,and E-caderin expression was decreased in the model group (P<0.05).Compared with the model group,the expressions of ILK,FN,and α-SMA were obviously decreased (P<0.05),and E-caderin expression was increased in all treated groups,with the better effects in Semen + safflower group.Conclusion Persicae Semen and safflower produces protection on renal function and renal tubular in UUO rat.This mechanisms might be related to increasing E-cadherin expression and decreasing the expressions of ILK,FN and α-SMA.

Persicae Semen; safflower; unilateral ureteral obstruction; integrin-linked kinase

贵州省联合基金资助项目(NO：黔科合J字LKZ[2010]37)。

陈阳，男，博士，教授，硕士生导师，研究方向：中药药理学，E-mail:chenyang197732@hotmail.com。

R285.5

A

1000-2715(2017)02-0134-05