七氟烷对大鼠海马Tau蛋白基因的调控作用及其对认知的影响

许凌懿，谢 笛，朱宇航，朱昭琼

(1.遵义医学院附属医院 麻醉科，贵州 遵义 563099；2.贵州省麻醉与器官保护基础研究重点实验室，贵州 遵义 563099)

基础医学研究

七氟烷对大鼠海马Tau蛋白基因的调控作用及其对认知的影响

许凌懿1，谢 笛2，朱宇航1，朱昭琼1

(1.遵义医学院附属医院 麻醉科，贵州 遵义 563099；2.贵州省麻醉与器官保护基础研究重点实验室，贵州 遵义 563099)

目的 探讨新生期大鼠重复七氟烷麻醉后海马内Tau蛋白mRNA表达水平的改变程度及其对认知功能的影响。方法 SPF级7日龄健康SD大鼠36只，体重15～18 g，雌雄不拘。首先随机分为两个组：2.6%七氟烷组(Sev2.6组，n=18)和对照组(Con组，n=18)。于大鼠出生后第7天(P7)、第14天(P14)和第21天(P21)进行重复七氟烷吸入麻醉处理及对照处理，Sev2.6组吸入2.6%七氟烷2 h，Con组吸入O21 L/min +Air 1 L/min 的混合气体。再据大鼠生长的不同时期随机分为3个亚组(新生期、幼年期、成年期)，于幼年期、成年期大鼠行Morris水迷宫实验检测大鼠行为学变化。水迷宫实验结束后立即取海马组织，采用RT-qPCR法测定Tau蛋白mRNA的表达水平。结果 随测试天数的增加，两组大鼠在幼年期、成年期逃避潜伏期均呈缩短趋势，并且在第3、4、5天之间比较差异无统计学意义(P>0.05)。在幼年期和成年期两组大鼠逃避潜伏期、原平台象限滞留时间、原平台象限路程、平均速度、经过平台次数等指标组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。幼年期Sev2.6组大鼠海马中Tau蛋白mRNA表达量为1.44±0.43，较Con组Tau蛋白mRNA表达量(0.93±0.13)明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)，而在新生期、成年期两组大鼠海马中Tau蛋白mRNA表达量差异无统计学意义(P>0.05)。结论 新生期重复2.6%七氟烷吸入麻醉后可导致大鼠海马Tau蛋白mRNA表达的一过性上调，但不引起认知功能的损害。

七氟烷；认知功能；海马；Tau蛋白；mRNA

七氟烷因其诱导迅速、苏醒快且平稳等特点，是儿科手术中常用的吸入麻醉药[1]。如今多数患儿因唇腭裂修补、喉乳头状瘤切除、骨折固定及内固定取出等需要间断重复手术。Wilder等[2]在对全麻手术患儿的临床回顾性研究中发现，小儿4岁前接受≥2次全身麻醉后认知功能障碍的发生风险明显高于单次全麻。因此，反复使用七氟烷麻醉是否对患儿认知功能产生不良影响亟待研究。Le Freche等[3]研究发现，成年小鼠单次吸入不同浓度七氟烷，可发生浓度依赖性海马区Tau蛋白可逆性磷酸化，得出七氟烷吸入浓度的改变会引起海马区蛋白结构的变化，进而产生了认知功能的损伤。这一研究提示，七氟烷吸入次数的变化是否也会对海马区蛋白产生相关的影响，从而损害认知。故本实验研究新生期大鼠重复七氟烷麻醉后海马Tau蛋白mRNA表达水平的改变，探讨与认知功能之间的关系。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 七氟烷(山东鲁南贝特制药有限公司)、RNAiso Plus(日本TaKaRa公司)、PrimeScriptTM RT reagent Kit(日本TaKaRa公司)、iQTMSYBR@ Green Supermix(美国Bio-Rad公司)及引物(日本TaKaRa公司)；Fabius麻醉机(德国Drager公司)、Vamos气体监护仪(德国Drager公司)、七氟烷挥发罐(美国雅培公司)、Morris水迷宫测试仪(成都泰盟科技有限公司)、CFX ConnectTM荧光定量PCR检测系统(美国Bio-Rad公司)。

1.2 实验动物及分组 SPF级7日龄健康SD大鼠36只，雌雄不拘，体重15～18 g(购于重庆第三军医大学实验动物中心，许可证号：SCXK(渝)2012-0005)。新生期内大鼠与母鼠同笼饲养，母乳喂养至出生后第28天与母鼠分笼饲养，按照国家啮齿类动物干燥饲料饲养标准喂食，饲养环境安静，室温控制在20～24 ℃，相对湿度50%～60%，自然昼夜明暗循环。采用随机数字表法将大鼠分为两个组：2.6%七氟烷组(Sev2.6组，n=18)和对照组(Con组，n=18)，每组大鼠又根据检测不同的生长时期分为3个亚组：新生期组(0～21 d，n1=12)、幼年期组(22～60 d，n2=12)、成年期组(60 d～20个月，n3=12)。

1.3 麻醉处理 所有大鼠于出生后第7天(P7)、第14天(P14)和第21天(P21)进行重复七氟烷吸入麻醉处理及对照处理。自制有机玻璃吸入麻醉箱(75 cm×40 cm×15 cm)，与麻醉机回路相连，气体监测仪持续监测保证进气孔和出气孔气体浓度一致，Sev2.6组吸入浓度为2.6%七氟烷，Con组吸入空氧混合气体(O21 L/min+Air 1 L/min)，待气体平衡后放入大鼠持续吸入2 h，吸入时间从大鼠麻醉起效(大鼠夹尾反射消失)开始计时，Con组以气体平衡放入大鼠即开始计时。吸入过程中控制箱温在30～34 ℃，密切观察大鼠呼吸情况及皮肤色泽，将出现紫绀及呼吸暂停的大鼠立即终止实验并予以剔除。吸入结束后取出大鼠置于自然环境中苏醒，待完全清醒后放回原饲养环境饲养。为确定2 h的麻醉对大鼠呼吸的影响程度，监测并记录随机6只大鼠每间隔30 min的SpO2及呼吸频率。

1.4 行为学检测 Morris水迷宫实验[4]是当前公认检验啮齿类动物学习记忆能力的行为变化最有效的方法，通过行为学的变化反映认知功能中学习记忆能力的影响。基于本课题组前期大量的实验结果表明，新生期大鼠无法耐受长时间水迷宫训练，并且相关的文献报道均从28 d以后开始进行[5-6]，故本实验通过Morris水迷宫仅研究幼年期、成年期大鼠行为学变化。水迷宫设备由圆形水池、可移动平台以及图像采集记录系统3部分组成。将盛有水的圆形铁皮水池[直径 120 cm ，高60 cm，水深 32 cm，水温(25±1)℃]平均划分为4个象限，依逆时针命名为一、二、三、四象限。放600 g奶粉入水使水池呈乳白色，并保持水迷宫外参照物不变。在定位航行实验中，将与水池背景同色直径为20 cm可移动平台隐藏于第四象限中央水下2 cm，此时肉眼无法直视平台。水池正上方通过一摄像机与监视器和计算机连接，可自动跟踪并记录下大鼠的游泳轨迹，并计算出实验指标的数据。①适应性训练：将幼年期大鼠P31、成年期大鼠P91放入没有平台的池中游泳120 s，以适应环境和剔除不会游泳而漂浮的大鼠。②定位航行实验：幼年期(P32～P36)和成年期(P92～P96)分别进行为期5 d的定位航行实验。每天将大鼠面向池壁分别从4个象限盆壁中点处放入水中，从入水到找到隐藏平台的时间记为逃避潜伏期，若大鼠120 s内未找到平台则指引其爬上平台并休息10 s，逃避潜伏期记为120 s，取当天4个象限逃避潜伏期平均值为实验成绩。③空间探索实验：分别在幼年期大鼠P37、成年期大鼠P97进行。撤去平台，大鼠从平台象限的对侧象限面向盆壁入水，游泳120 s，记录原平台象限滞留时间，经过原平台象限路程，平均速度以及经过平台次数等指标。

1.5 海马Tau蛋白mRNA水平测定 于新生期大鼠第三次吸入麻醉结束的当天(P21)、幼年期和成年期空间探索实验结束后当天(P36和P96)，1%戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔注射麻醉后，取脑组织于冰盘上分离出海马组织，置于-80 ℃冰箱中保存。采用RT-PCR法检测海马Tau蛋白 mRNA水平，取海马标本解冻后，用研磨杵充分匀浆至组织完全裂解，4 ℃ 12 000 rpm离心10 min，取上清液加入氯仿0.2 mL，剧烈震荡后静置10 min，4 ℃ 12 000 rpm离心15 min，再取上清液，加0.2 mL异丙醇，颠倒混匀后室温沉淀10 min，于4 ℃ 12 000 rpm离心15 min后，弃上清液。加入75%乙醇1 mL，4 ℃ 7 500 rpm离心15 min后弃去上清液。将EP管倒置于滤纸上室温下自然干燥，以去酶水50 μL 溶解。采用紫外分光光度计测定光密度值(A260/A280)，比值为1.8～2.0，满足实验要求。根据GeneBank中目的基因全序列，由TaKaRa生物工程公司合成Tau基因mRNA上游引物：5＇-CCTGAGCAAGGTGACCTCCAA-3＇、下游引物：5＇-GGGACATGGGTGATGTTATCCAA-3＇，扩增片段150 bp；β-actin 上游引物: 5＇-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3＇；β-actin 下游引物: 5＇-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3＇，扩增片段150 bp。定量PCR反应体系为10 μL，Tau蛋白mRNA和β-actin反应条件循环设置：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性35 s，60 ℃退火30 s，循环40 次。结果采用相对定量法分析处理。以PCR扩增过程中荧光信号强度达到阈值所需要的循环系数(Ct)为统计参数，基因的表达= 2-△△CT(△△CT=Ct平均值-Ct中间值)；相对表达量=目的基因的表达(Tau蛋白mRNA)/内参基因的表达(β-action)×100%。

1.6 观察指标 Sev2.6组和Con组所有观察指标均在同一实验条件下采集、处理。

2 结果

2.1 一般情况 吸入七氟烷麻醉期间各组大鼠呼吸平稳，皮肤色泽红润，麻醉后苏醒良好。适应性训练中未发现不会游泳的大鼠，各组实验大鼠均顺利完成Morris水迷宫的行为学测试，无意外死亡。随机抽取的6只大鼠吸入麻醉过程中各时间点SpO2、呼吸频率均在正常值范围，各时间点SpO2与麻醉前比较，差异无统计学意义(P>0.05)；麻醉后30 min、1、1.5 h呼吸频率分别较麻醉前明显减慢，差异有统计学意义(P<0.05)，大鼠苏醒后呼吸频率与麻醉前比较，差异无统计学意义(P>0.05，见表1)。

观察指标麻醉前麻醉后30min麻醉后1h麻醉后1.5h苏醒后SpO2(%)呼吸频率(次/min)97.2±0.8107.5±8.896.5±1.089.2±8.0a96.5±1.683.9±5.4a96.7±1.271.8±4.1a96.8±1.5101.8±8.8

与麻醉前比较，aP<0.05。

2.2 行为学检测结果

2.2.1 幼年期两组大鼠分别组内各天间比较，逃避潜伏期差异均无统计学意义(P>0.05)，但随着测试天数的增加，与定位航行第1天相比，逃避潜伏期呈缩短趋势，在第3、4、5天之间比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2.2 成年期大鼠Sev2.6组和Con组分别组内比较，随测试天数的增加，与定位航行第1天相比，逃避潜伏期逐渐缩短，差异有统计学意义(P<0.05)，并且两组大鼠在第3、4、5天之间比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2.3 幼年期和成年期大鼠Sev2.6组与Con组比较，逃避潜伏期、原平台象限滞留时间、原平台象限路程、平均速度、经过平台次数各指标组间比较差异无统计学意义(P>0.05，见表2～3)。

组别幼年期(n2=12)第1天第2天第3天第4天第5天成年期(n3=12)第1天第2天第3天第4天第5天Sev2.647.91±8.0425.26±12.5332.32±33.5824.29±14.1324.98±10.9942.01±14.1226.87±16.93a19.80±13.76a15.06±8.45a8.66±4.82abCon59.09±36.6233.84±15.2123.79±9.49 20.00±10.1014.03±7.55 41.97±25.6622.88±10.04a15.88±5.20a9.26±3.98a11.33±6.05a

组内比较，与定位航行第1天比较，aP<0.05；与定位航行第3天比较，bP<0.05。

组别幼年期(n2=12)原平台象限滞留时间(s)原平台象限路程(mm)平均速度(mm/s)经过平台次数成年期(n3=12)原平台象限滞留时间(s)原平台象限路程(mm)平均速度(mm/s)经过平台次数Sev2.628.16±5.357726.04±1192.47276.20±15.354.67±2.7325.02±6.176459.19±1716.87258.84±34.332.83±1.33Con25.65±4.167292.18±840.31 287.66±35.303.17±2.4828.05±4.717716.37±1626.62281.48±75.353.33±1.21

2.3 海马Tau蛋白mRNA的表达量分析 幼年期大鼠Sev2.6组与Con组比较，海马中Tau蛋白mRNA表达量增加，差异有统计学意义(P<0.05)；新生期大鼠Sev2.6组与Con组比较，Tau蛋白mRNA表达量差异无统计学意义(P>0.05)；成年期大鼠Sev2.6组与Con组比较，Tau蛋白mRNA表达量差异无统计学意义(P>0.05，见表4)。

组别新生期(n1=12)幼年期(n2=12)成年期(n3=12)Sev2.60.82±0.141.44±0.43a0.69±0.10Con0.81±0.210.93±0.130.64±0.14

与Con组相比，aP<0.05。

3 讨论

Morris水迷宫是目前公认的通过观察大鼠行为学改变检测大鼠学习记忆能力改变的经典实验方法，在认知功能领域研究中被广泛应用。大鼠的学习记忆能力包括陈述性记忆能力和空间联想与回忆探究能力。定位航行实验结果既能体现大鼠的陈述性记忆能力又能使大鼠通过学习过程形成空间参考记忆。而空间探索实验即是大鼠对已形成的空间参考记忆的提取，属于空间联想与回忆探究能力范畴[7-8]。本研究中的实验结果表明，随测试天数的增加，幼年期、成年期两组大鼠逃避潜伏期均呈缩短趋势，并且在第3、4、5天之间比较差异无统计学意义，说明各组大鼠通过学习能力已形成了稳定的空间参考记忆。幼年期和成年期大鼠逃避潜伏期及空间探索实验各指标组间比较差异无统计学意义，证明大鼠哺乳期内重复七氟烷麻醉未对幼年期及成年期的学习记忆能力产生损害。

有研究报道，大鼠吸入麻醉后引起的海马结构改变、神经变性以及神经电生理功能受损等，会使大鼠产生持续性的认知功能障碍[9]。因而，海马区的相关蛋白和基因表达水平的改变是目前研究认知功能损害的热点方向。Tau蛋白是海马神经细胞主要的微管相关蛋白，微管相关蛋白Tau基因经转录、翻译后形成Tau蛋白，Tau基因突变可导致Tau蛋白表达水平异常和结构紊乱，从而可导致一系列神经退行性疾病病理改变[10]。本实验结果发现新生期间断重复吸入七氟烷麻醉后会引起幼年期大鼠海马中Tau蛋白mRNA表达上调，但当大鼠生长到成年期后，Tau蛋白mRNA表达量并未出现相同的上调趋势。说明在大鼠动态的生长发育过程中，重复的七氟烷吸入麻醉后对Tau蛋白mRNA表达水平的影响只是一过性的发生在幼年期，并未延续至成年期，其原因在于大鼠的幼年期正是处于神经发育的生长爆发期，该时期除对内外环境的变化异常敏感外，同时还具有较强的修复作用，随着这种自我修复的作用存在，Tau蛋白mRNA表达水平的变化仅在幼年期呈现为一过性的上调。

综上，重复七氟烷麻醉可引起大鼠海马中Tau蛋白mRNA的表达量一过性上调，但不能引起大鼠行为学的改变，即不损害大鼠的认知功能，考虑其原因可能为：①新生期重复七氟烷麻醉后对认知功能的影响可能不是Tau蛋白基因表达量改变独立作用的结果，而是多种基因标记物及相应表达产物蛋白之间相互关联的结果[11]。②海马Tau mRNA的表达量与影响药物之间可能存在剂量依赖关系，本实验结果可推断该浓度下的七氟烷麻醉后引起的Tau蛋白mRNA表达的上调程度可能不足以导致大鼠认知功能障碍，同时提示了若提高七氟烷吸入的浓度后对海马Tau基因表达调控作用的影响程度可能不同，我们将进一步探讨并对比不同剂量的研究。

因此，新生期大鼠重复吸入2.6%的七氟烷后仅引起幼年期海马Tau蛋白mRNA表达水平的上调，但未导致大鼠任何时期的行为学改变，说明新生期重复2.6%的七氟烷吸入麻醉后仅可导致Tau蛋白mRNA表达的一过性上调，但这种上调不引起认知功能的损害。

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[收稿2017-02-16;修回2017-03-05]

(编辑：王静)

Effects of sevoflurane anesthesia on Tau mRNA expression in rat hippocampus and the cognition

XuLingyi1,XieDi2,ZhuYuhang1,ZhuZhaoqiong1

(1.Department of Anesthesiology,Affiliated Hospital of Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China; 2.Guizhou Key Laboratory of Basic Research for Anesthesia and Organ Protection,Zunyi Guizhou 563099,China)

Objective To study the effects of repeated sevoflurane anesthesia on Tau mRNA expression in hippocampus and investigate the relationship between the Tau mRNA expression and the ability of learning and memory in neonatal rats.Methods Thirty-six healthy Sprague-Dawley rats were randomly divided into two groups,control group (n=18) and sevoflurane group (n=18).The sevoflurane group was given 2.6% sevoflurane inhalation anesthesia for 2 h at the postnatal 7th days,14th days and 21st days (P7,P14 and P21).Control group was given mixed carrier gas (the proportion of 1∶1 oxygen and air) for 2 h at the same days.The behavior was tested through Morris water maze test in two groups at juvenile and adult period.After the behavior test,hippocampal specimens were obtained for determination of the expression of Tau mRNA by RT-qPCR.Results In juvenile and adult periods,the escape latency in two groups became shorter over time,and there was no statistical difference between two groups at the 3,4 and 5 d (P>0.05).No significant change was found between two groups in the escape latency,the time of staying at the original platform quadrant,the distance of swimming in the original platform,the average speed of swimming and the frequency of crossing the original platform during juvenile and adult period (P>0.05).In the juvenile period,the expression of Tau mRNA in the hippocampus of sevoflurane group was higher than that in the control group (P<0.05).No difference of Tau mRNA expression between neonatal and adult periods was shown (P>0.05).Conclusion The repeated 2.6% sevoflurane inhalation in the neonatal period could increase the expression of Tau mRNA in the hippocampus of juvenile rats with no behavior changes in juvenile and adult periods.

Sevoflurane; cognitive ability; hippocampus; protein Tau; mRNA

国家自然科学基金资助项目(NO：81660193)；贵州省科技厅技术基金资助项目(NO：黔科合J字LKZ[2012]04)。

朱昭琼，女，博士，教授，硕士生导师，研究方向：吸入麻醉、临床麻醉，E-mail:xly0101mz@163.com。

R614.2

A

1000-2715(2017)02-0129-05