不同产地浙贝母药材HPLC-ELSD指纹图谱的研究

朱广磊 睢宁 张春椿 俞冰 李石清 张水利 熊耀康

浙江中医药大学 杭州 310053

不同产地浙贝母药材HPLC-ELSD指纹图谱的研究

朱广磊 睢宁 张春椿 俞冰 李石清 张水利 熊耀康

浙江中医药大学 杭州 310053

[目的]建立不同产地浙贝母药材HPLC-ELSD指纹图谱，为科学评价和有效控制其质量提供可靠方法。[方法]采用HPLC-ELSD测定21个不同产地的浙贝母药材样品，建立指纹图谱共有模式图，并通过指纹图谱相似度计算、指纹图谱聚类分析、指纹图谱主成分分析，对不同产地浙贝母药材进行区分研究。[结果]建立了浙贝母药材指纹图谱共有模式图，包含9个共有特征峰。以共有模式对21个不同产地的药材进行指纹图谱相似度评价，浙江缙云溪丘、永康、江苏南通浙贝相似度最低(＜0.8)，浙江磐安地区浙贝相似度最高(＞0.9)。指纹图谱聚类分析、主成分分析，将不同产地样品分为3类。[结论]浙贝母药材的指纹图谱分析可以为其质量评价提供一定的理论基础。

浙贝母；HPLC-ELSD；指纹图谱；聚类分析；定性分析；产地；质量；道地药材

浙贝母为百合科(Liliaceae)植物浙贝母（Fritillaria thunbergii Miq．）的干燥鳞茎，味苦，性寒，归肺心经，具有清热化痰、散结解毒之功效。现代药理研究发现，浙贝母具有祛痰、镇咳、抗病原微生物等作用[1]。同时，现代研究还表明，浙贝母生物碱是其止咳、化痰和平喘等作用的有效成分[2]。故临床上常用于肺热痰火咳嗽、心胸郁闷、疮毒、瘰疬、乳痈、肺痈等症[3]。现浙贝母大多采用HPLC进行含量测定和质量评价,本文在筛选出最佳色谱条件的基础上,采用HPLC-ELSD测定了21批来自不同产地的浙贝母药材样品，得出不同产地浙贝母HPLC-ELSD指纹图谱，采用中药色谱指纹图谱相似度软件进行评价，并通过指纹图谱聚类分析、主成分分析对不同产地浙贝母药材进行区分研究，以期为浙贝母药材质量评价提供一定的理论依据。

1 实验材料

1.1 仪器 Waters1525高效液相色谱仪（美国Waters公司）；ELSD检测器（美国Waters公司）；Empower 2色谱工作站（美国Waters公司）；Hypersil C18(250 mm×4.6mm，5μm)（大连依利特分析仪器有限公司）；KQ2200DA型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；AR224CN电子天平（奥豪斯仪器（上海）有限公司）；B-220型电热恒温水浴锅（上海亚荣生化仪器厂）。

1.2 试剂 甲醇（分析纯，批号：08010，上海三鹰化学试剂有限公司）；乙腈（色谱纯，批号：3BA0015，Spectrum Chemical Mfg.Corp.）；氯仿（分析纯，批号：T20080313，国药集团化学试剂有限公司）；贝母素乙标准品（批号：110750-201110，中国生物制品检定所）；贝母素甲标准品（批号：110751-200709，中国生物制品检定所）。

1.3 药材 浙贝母药材采于浙江磐安、宁波、东阳、缙云、永康、江苏海门、南通等地，并经浙江中医药大学张水利教授鉴定为百合科植物浙贝母(Fritillaria thunbergii miq.)的鳞茎（表1）。按2010版药典《中国药典》浙贝母项下规定加工：取鳞茎，大小分开，洗净，除去芯芽，趁鲜切成厚片，洗尽干燥，粉碎，过4号筛，室温保存。

表1 浙贝母药材编号及来源Tab.1 Number and source of Fritillaria thunbergii Miq

2 方法与结果

2.1 色谱条件 本实验色谱条件在前人[4-8]研究的基础上进一步优化得出。最佳色谱条件为：Hypersil BDS色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；甲醇(含0.05%三乙胺)（A）-水（B）为流动相，梯度洗脱0～10min，45%～55% A，10～30min，25%～75%A，30～45min，12%～88%A，45～60min，5%～95%A；流速1.0mL·min-1；蒸发光散色检测器(ELSD)检测参数：漂移管温度55℃，增益值为2，氮气流速40psi，进样量为20μL。

2.2 对照品溶液制备 取贝母素甲对照品、贝母素乙对照品适量，精密称定，加甲醇溶解，配制成1.0mL含贝母素甲0.20mg、贝母素乙0.22mg的混合溶液，即得。

2.3 供试品溶液制备 根据2010版中国药典中浙贝母提取方法稍加改进制备供试品溶液。取本品粉末（过四号筛）约2g，精密称定，置锥形瓶中，加浓氨水4mL浸润0.5h，精密加入氯仿-甲醇(4:1)的混合溶剂40mL，称定，混匀，置超声仪（80W）中超声1.0h，放冷，再称定，加上述混合溶剂，补足质量，滤过，精密量取续滤液10ml，置蒸发皿中蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至10mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，经微孔滤膜法（0.45μm）过滤，备用。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度实验 取同一份供试品溶液，连续进样5次，共有色谱峰（峰1～峰9）的相对保留时间的RSD均小于2.0%，相对峰面积均小于5.0%，表明精密度良好。

2.4.2 稳定性实验 取同一份供试品溶液分别在0、4、6、8、10、12和24h不同时间点进行检测，共有色谱峰（峰1～峰9）的相对保留时间的RSD均小于3.0%，相对峰面积均小于5.0%，表明稳定性良好。

2.4.3 重复性实验 取同一批次供试品5份，按照供试品制备和检测方法制备供试品并分别进行检测，共有色谱峰（峰1～峰9）的相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于5.0%，表明稳定性良好。

2.5 浙贝母药材指纹图谱的建立 按照中药指纹图谱研究技术要求[9]，对1～21号样品分别检测其色谱峰，记录60min色谱图。运用国家药典委员会中药色谱相似度评价系统[10]（2004A版）软件对21批药材的色谱峰进行匹配并生成共有峰模式图（图1）。在浙贝母指纹图谱上，共有9个峰是21批浙贝母药材所共有，因此将其确定为特征指纹色谱峰，并依次编号1～9，以8号峰分离度好，作为参照峰，相对保留时间与相对保留面积均设为1，得到其他各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。见表2、表3。

比较标准品和样品峰的保留时间和色谱图可知，其中8号和7号峰分别为贝母素甲和贝母素乙对照品。贝母素甲和贝母素乙对照品色谱图（图2），空白对照图见图3。

2.6 指纹图谱相似度评价 以浙贝母共有模式图谱作为对照图谱，对21批浙贝母药材进行相似度评价。相似度用Excel软件，参照文献《Excel 2002在中药指纹谱相似度计算中的应用》[11]，分别以相关系数法和夹角余弦法计算浙贝母药材样品图谱与共有模式的相似度，结果见图4、表4、表5。

图1 浙贝母药材共有峰模式图Fig.1 Common peak pattern diagram of Fritillaria thunbergii Miq

图2 贝母素甲和贝母素乙混标图Fig.2 Peimine and peiminine mixed plotting

图3 空白对照图Fig.3 Blank control chart

图4 不同产地浙贝母药材指纹图谱（n=21，从下到上编号为1,2,3，……21）Fig.4 Fingerprint of Fritillaria thunbergii Miq from different habitats（from bottom to top numbered 1,2,3，……21）

表2 浙贝母指纹图谱共有峰的相对保留时间Tab.2 Fingerprint relative retention time of Fritillaria thunbergii Miq

表3 浙贝母指纹图谱共有峰的相对峰面积Tab.3 Fingerprint relative peak areas of Fritillaria thunbergii Miq

表4 样品中位数矢量相似度评价Tab.4 Median vector similarity evaluation of samples

表5 样品平均值矢量相似度评价Tab.5 Average vector similarity evaluation of samples

由表4样品中位数矢量相似度评价结果可知,按相关系数法评定，第1、18、19批样品指纹图谱的相似度在0.70～0.78之间，相似度较低；第15、16、17、21批样品指纹图谱的相似度在0.80～0.88之间相对较低，其余的相似度均在0.90以上,相似度较高。按夹角余弦法评定，仅第1、15、16、18、19批样品指纹图谱的相似度在0.83～0.88之间；其余均在0.90以上,相似度较高。可以按相似度进行区分。由表5样品平均值矢量相似度评价结果可知,按相关系数法评定,第1、18、19批样品指纹图谱的相似度在0.64～0.73之间，相似度低；第15、16、21批样品指纹图谱的相似度在0.85～0.89之间；其余均在0.90以上,相似度较高。按夹角余弦法评定,仅第1批样品的相似度在0.80以下,较低；第16、18、19、20批样品的相似度在0.81～0.89之间；其余均在0.90以上,相似度较高。其中15、20、21批浙贝母鳞茎经相关系数和夹角余弦计算后只有一种计算相似度结果在0.90以上，因为相关系数和夹角余弦在原理上有一定的差异性[12]。

2.7 指纹图谱聚类分析 将上述不同产地浙贝母样本看作一个整体，通过比较不同样本间相对峰面积变量间的性质与特征，即用所有峰的面积除以8号峰的面积，然后用SPSS18.0软件对21个浙贝母样本的相对峰面积标量进行系统聚类，按欧氏距离进行度量，用最小距离法进行聚类，其样本聚类结果（图5）。结果显示：21批不同产地浙贝母样品可以聚为三大类，即第15、16批分为I类，第1、2、3、19批为II类，剩余的归为III类。I类为宁波浙贝母，II为缙云和江苏南通浙贝母,III类为江苏海门、永康和东阳浙贝与磐安的浙贝母。其中江苏海门、永康和东阳浙贝与磐安的浙贝同聚为III类，可能是由于这些地区的浙贝母都是从江苏海门引种的原因；从分类距离上看，即使是相同产地浙贝母也存在一定的差异。个共有峰的峰面积值用SPSS19.0统计软件进行主成分分析（PCA），结果（图6）。从图中可以看出第1、18、19批与第15、16、17批远离其他样品,这些样品为缙云溪丘、永康、江苏南通、宁波、东阳三联镇浙贝,区别于其它产地样品；尤以第1、18、19批浙贝母样品与其它浙贝母相比,差异较大。结果还显示浙贝母样品集中区基本为浙江磐安地区所产，但缙云壶镇、江苏海门与其并未能区分开来。21个产地浙贝母样品可大

图5 样品聚类分析Fig.5 Cluster analysis of samples

2.8 指纹图谱主成分分析 将21批浙贝母样品中9致聚为三类，见图6，主成分分析其结果与相似度分析和聚类分析基本一致。

图6 样品主成分分析Fig.6 Principal component analysis of samples

由表6可知，前三个主成分特征值大于1，累计贡献率达到87.422%，说明这三个主成分包含信息较多，且第一主成分方差贡献率达到51.916%，贡献率最大，包含信息最多。将表7中主成分载荷矩阵中每个成分的值除以主成分对应的特征值的平方根，得到3个主成分中每个峰所对应的系数，得到表达式：

F1＝0.4486 X1＋0.2512 X2＋0.4196 X3＋0.3659 X4-0.1109 X5＋0.2913 X6＋0.4561 X7＋0.4501 X8＋0.3106 X9

F2＝-0.3312 X1＋0.5519 X2＋0.3196 X3＋0.4334 X4＋0.2456 X5＋0.1913 X6-0.3442 X7-0.4152 X8＋0.2175 X9F3＝0.0918 X1-0.3517 X2-0.1187 X3＋0.2573 X4＋0.7896 X5＋0.1491 X6＋0.1482 X7＋0.1466 X8＋0.0787 X9

3个主成分中，F1的特征值最大，最能代表主成分中包含的信息，其中系数较大的为相对应的X1、X7、X8，相应的色谱峰为1、7、8，说明这3个色谱峰的含量对于浙贝母质量控制起着至关重要的作用。

3 讨论

本实验采用 HPLC-ELSD测定了21个不同产地的浙贝母药材样品，得到了指纹图谱共有模式图，并在这21个产地内进行比较，结合相似度分析、聚类分析以及主成分分析区分出不同产地间样品的差异。本方法可为浙贝母药材的鉴别和质量控制提供一定的理论依据。

本文首次分别以相关系数法和夹角余弦法评定浙贝母药材样品图谱与共有模式的中位数矢量相似度及样品平均值矢量相似度。相似度越高说明浙贝母样品间化学成分均一性越好。从相似度结果可知：不同产地浙贝母样品中化学成分存在差异，相同产地浙贝母样品中化学成分具有良好的相似性，质量稳定较好；磐安地区的浙贝母相似度基本在0.9以上质量稳定较好，缙云溪丘、永康、宁波、江苏南通浙贝的相似性均小于0.9，指纹图谱相似度较低原因可能与药材的生长环境与生长条件有关。这进一步证实了药材的道地性之说。结果还表明,中位数矢量法和平均数矢量法的结果稍有差异，均可以看出1、18、19号样品相似度最低,说明其化学成分均一性最差。

本实验将21批不同产地浙贝母样品可以聚为三大类，即15、16分为I类，1、2、3、19为II类，剩余的归为III类。I类为宁波浙贝母，II为缙云和江苏南通浙贝母，III类为江苏海门、永康和东阳浙贝与磐安的浙贝母。较相似度分析，聚类分析没能将缙云和南通产地浙贝区分开，据笔者实地考察，缙云、永康、磐安、东阳产地浙贝母的母种均是从江苏购买，这个在相似度分析中没有能够很好地体现出来，而宁波浙贝母则是农户自己留种，可能是这个原因使得相似度分析和聚类分析均将宁波浙贝母分别出来，而从江苏引种到浙江环境上的改变对浙贝母的影响比较显著，像浙江缙云产地浙贝母。不同产地浙贝母生理生化特性存在差异，所含微量元素也有差异，加上不同产地其环境不同可能会导致其有效成分的含量差异[13-14]。但其种源引自浙江，故其差异性多是受环境影响而形成，引种时间越久其种间会越来越凸显出差异，刚引种到一个新的环境，由于要适应新环境也可能会造成比较大的差异。主成分分析中得出色谱峰1、7、8为主要色谱峰，结合标准品对照可知，7、8分别为贝母素乙、贝母素甲，其中色谱峰1有待进一步确定。21批浙贝母样品通过聚类方法被聚为三类，与相似度分析和主成分分析结果基本一致，由此可见，该聚类谱系从一定程度上可以反映出浙贝母药材质量与道地产地及种源的相关性。

表6 浙贝母主成分分析特征值与贡献率Tab.6 Eigenvalue and contribution rate of Fritillaria thunbergii Miq cluster analysis

表7 浙贝母成分分析结果因子载荷矩阵Tab.7 Factor loading matrix of Fritillaria thunbergii Miq component analysis results

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Study on HPLC-ELSD Fingerprint of Fritillaria Thunbergii from Different Places

ZHU Guanglei,SUI Ning,ZHANG Chunchun,et al
Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou(310053)，China

[Objective]To establish the HPLC-ELSD fingerprint of Fritillaria thunbergii from different places,providing a reliable method for scientific evaluation and effective control of its quality.[Methods]Fritillaria thunbergii samples from 21 different places were determined by HPLC-ELSD to establish fingerprint common pattern,and through the analysis of fingerprint similarity calculation and clustering,principal component analysis to distinguish Fritillaria thunbergii from different places.[Results]Common pattern of Fritillaria thunbergii Miq is established,which includes 9 common peaks,similarity evaluation of the 21 Fritillaria thunbergii from different places in common mode indicates similarity of Fritillaria thunbergii from Zhejiang Jinyun,Yongkang, Jiangsu Nantong is lowest(＜0.8),Fritillaria thunbergii from Zhejiang Pan'an is highest(＞0.9).In cluster analysis and principal component analysis,the samples from different places are divided into 3 groups.[Conclusion]The fingerprint of Fritillaria thunbergii can provide some theoretical basis for its quality evaluation.

Fritillaria thunbergii Miq;HPLC-ELSD;fingerprint;cluster analysis;qualitative analysis;producing areas;quality;famous region drug

R282.71

：A

：1005-5509（2017）05-0352-10

10.16466/j.issn1005-5509.2017.05.002

2017-01-11）

中央本级重大增减支项目（2060302）；国家中医药行业科研专项（201407002）；国家自然科学基金资助项目（81603222）

Fund projects:Significant increase and decrease of the central level projects（2060302）;National scientific research project of national traditional Chinese medicine(201407002);National Natural Science Foundation of China（81603222）

张水利，E-mail：zhang_shuili@163.com