分子线性探针杂交方法用于耐多药结核病耐药性分析的应用研究

包训迪 王超 阚晓红 王庆

分子线性探针杂交方法用于耐多药结核病耐药性分析的应用研究

包训迪 王超 阚晓红 王庆

目的 评价分子线性探针杂交方法(LPA)在快速检测耐多药结核病人耐药性的应用价值。方法 利用分子线性探针杂交方法检测415例结核分枝杆菌临床分离株，同时使用常规药敏方法对样本进行抗结核药物敏感性测试。结果 线性探针杂交法检测415例结核分枝杆菌临床分离株RFP和INH耐药性的灵敏度、特异性分别为91.43%、94.20%和75.68%、95.89%，两种检测方法的kappa值分别为0.830、0.731；线性探针杂交法检出MDR的敏感度和特异度分别为75.44%、95.25%，两种检测方法的kappa值为0.692。线性探针杂交法检测的耐药株中RFP常见的突变型主要分布在WT7、WT8和MUT3(S531L)。结论 线性探针杂交法在结核病耐药分析中能够快速、准确的鉴定出RFP和INH的耐药性以及常见耐药基因型，能够大幅缩短药敏试验时间，便于及时用药治疗，对控制耐药结核病的传播有重要意义。

分子线性探针杂交；异烟胼；利福平；耐药

结核病(Tuberculosis，TB)是威胁全球公共卫生的常见感染性疾病。近年来随着国家加大对结核病的防控力度，结核病得到了一定程度的遏制；但耐药结核病却成了结核病的三大难题之一，耐药结核病的控制面临巨大挑战。目前，细菌学检查仍是耐药结核病诊断的主要手段，但由于传统细菌学方法耗时较长，一般需要2-3个月才能最终诊断为耐药结核病，这为耐药结核病的防控提出了巨大挑战。因此，耐药结核病的早期诊断和及时治疗对耐药结核病的防控具有重要意义。

随着医学技术的发展，分子生物学方法在耐药结核病诊断中的应用，极大缩短了耐药结核病的诊断时间，为耐药结核病的早期诊断方法的提供依据。线性探针技术(简称LPA)是近年来国家在全国推广的耐多药结核病快速诊断方法之一，我省已在16个市进行推广。为评价这种方法的应用效果，本研究组在2015年度对安徽省胸科医院415例培养阳性肺结核患者进行快速检测耐多药肺结核，并与传统结核菌培药敏试验作对照分析，结果如下。

资料与方法

一、材料和试剂

2015年我院培养阳性的415例临床肺结核患者标本。试剂采用MTBDR-Plus Kit(Hain life science．Germany)，高保真热启动酶(HotStar Taq酶) ，按试剂盒说明书操作。

二、研究方法

1. 采用病例对照方法 对所有病人培养阳性标本进行传统药敏试验和线性探针技术检测，临床标本的药敏试验参照《结核病实验室检验规程》[1]

2. 核酸提取 挑取1接种环菌，加500μL无菌蒸馏水中，充分混悬沉淀，85℃金属浴20 min灭活。13000g离心5min弃上清，加500μL无菌蒸馏水重悬，13000g离心5min弃上清，加100μL无菌蒸馏水，95℃金属浴20 min， 37kHz 80W超声15 min，13000g离心5 min后；将上清转移到另一管。5μL用于PCR扩增，剩余-20℃保存备用

3. PCR扩增和杂交 准备含有DNA聚合酶的扩增体系45μL,加5μL提取的DNA模板。上机扩增：95℃ 15 min；95℃ 30s，58℃ 2 min，10个循环；95 ℃ 25s，53℃ 40s，70℃ 40s，20个循环；70℃ 8min；4℃ 1h。直接取扩增产物2μL进行化学变性后，与带有探针固化的试纸条在GT48全自动杂交仪进行显色反应。

三、结果分析

结果判定(见图1)。RFP和INH突变检测图示，其中有4个质控探针，23个检测探针。当任一基因的野生位点出现显色缺失，或者突变位点有显色时，判定为耐药：野生位点未缺失，突变位点未显色，判定为敏感。如果质控探针或tub对照条带缺失，需要重复实验。

图1 RFP和INH突变示意图

四、统计学方法

应用统计学软件SPSS 19.0对两种方法检测结果一致性的Kappa值进行判别，若Kappa值≥0.75，表示两种方法取得相当满意的一致性，0.75> Kappa值≥0.4，表示两种方法的一致性比较满意，若Kappa值<0.4，表示两种方法的一致性不够理想。

结 果

一、线性探针技术检测利福平和异烟肼耐药性的性能以绝对浓度法药敏结果为准。线性探针技术检测利福平和异烟肼的灵敏度为91.43%和75.68%，利福平和异烟肼的特异性分别为94.20%和95.89%，两种方法检测RFP和INH耐药性的kappa值分别为0.830和0.731，(见表1、2)。

二、线性探针技术检测耐多药的性能以绝对浓度法药敏结果为准。线性探针技术的灵敏度为75.44%，特异性分别为95.25%，两种方法检测MDR-TB的kappa值为0.692(见表3)；两种方法用于MDR的检测无显著性差异，(见表3)。

表1 两种方法检测415例患者RFP耐药情况

表2 两种方法检测415例患者INH耐药情况

表3 两种方法检测415例患者耐多药情况

三、通过线性探针技术检测出的rpoB耐药基因80%以上的突变主要分布在WT7、WT8和MUT3(S531L)[2-3](见表4)。

讨 论

我国2007-2008年结核病耐药性基线调查和第五次全国结核病流行病学调查显示[4-5]，结核病耐药性已经成为目前结核病防治中的难题，根据WHO公布的数据，我国耐药结核病的控制仍有巨大提升空间，耐药结核病已成为我国结核病的控制难题，国家结核病防治在“十三”期间已将耐药结核病列为三大难点之一。有研究显示，耐药结核病的流行病学主要是通过人群之间传播[6]；因此耐药结核病的早期诊断和治疗对控制传播有重要意义。

表4 rpoB耐药基因分布

目前，我国基层结核病实验室对于耐药结核病的诊断主要仍依赖细菌学诊断，传统的药敏试验花费时间较长，一般需要4周时间才能得到药敏结果，在耐多药肺结核患者的早期诊断上无法发挥作用，满足不了临床需求。随着分子生物学方法的发展，近年来涌现出很多基于PCR原理的方法用于结核分枝杆菌的耐药性检测，线性探针方法是其中之一，该方法可以直接检测涂阳痰标本，可在8小时左右完成结核分枝杆菌耐药性检恻，极大的缩短了耐药性检测时间，能够及时为临床诊断提供科学依据[7-9]。

本研究采用临床结核病人的培养物作为标本，经过提取核酸DNA进行PCR扩增后，通过反相杂交方法检测结核分枝杆菌耐药基因的突变。研究结果显示，线性探针方法检测利福平和异烟肼的灵敏度分别为91.43%和75.68%，特异性分别为94.20%和95.89%，与李强等研究结果相似[10-11]，可以较大限度的发现耐药结核病人。在两种方法的一致性分析中可以看出，HAIN在检测RFP的耐药性有着相当满意的一致性，在检测INH和发现MDR病人是有着比较满意的一致性。

此外，LPA方法检测耐多药结核病的阳性率达到14.46%、传统药敏法是13.73%，二者差异无统计学意义。

本研究显示LPA方法检测耐多药结核病的阳性率略高于传统方法，经复做两项检测后，HAIN的重复性很高。与传统方法比较，传统方法可能存在技术方面的缺陷，受各方面因素的影响，而LPA方法比较直观，按照标准操作程序操作，可将影响因素控制在一定范围以内。此外，LPA方法的检测报告时间大为缩短，可作为耐药结核病快速检测的理想方法，可以为耐多药结核病人的早期诊断和治疗提供了技术保证。

有研究提示，耐RFP的患者约有70%是耐多药病人[12-13]，WHO建议通过检测RFP来完成对耐多药病人的快速筛查。本研究显示，我院RFP耐药的rpoB基因主要突变位点在WT8、WT7和MUT3，如表4所示，说明我院RFP的主要耐药基因的突变位点可能存在于526-533位，最常见是H526Y 和S531L突变。这些主要基因突变位点的分布，可为以后的基因检测方法的选择提供参考，可以据此选择有针对性的方法来进行耐多药病人的快速筛查[14]。

综上所述，线形探针技术具有时间短、灵敏度高、特异度好的特点，能够为耐多药结核病的早期发现和治疗提供诊断依据。但由于线性探针检测技术需要特殊设备和环境，操作技术和防污染措施要求严格，实验室必须是经过卫生部临检中心验收过的基因扩增诊断实验室才能开展临床检测工作，检测人员同样需要经过培训、严格按照标准化程序进行操作，按照基因扩正实验室的要求，仪器设备和耗材要做到专区专用，避免交叉污染，只有满足以上要求，线性探针技术才能作为耐多药结核病的快速诊断技术，才能更加有效的保护健康人群，在控制耐多药结核病疫情等方面才具有重大意义[15]。

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Application of LPA method in analysis of multi-drug resistant TB

BAOXun-di,WANGChao,KANXiao-hong,WANGQing.

DepartmentofLabrtory,AnhuiChestHospital,Hefei,Anhui230022,China

Objective To evaluate the application of molecular linear probe hybridization method (LPA) in rapid detection of multi-drug resistant tuberculosis. Methods It used LPA to detect 415 cases of mycobacterium tuberculosis clinical isolates. At the same time, it also used conventional DST method to detect the samples. Results The sensitivity and specificity of RFP and INH clinical isolates was 91.43% and 94.2%, and 75.68% and 95.89% respectively by LPA method, and the value of kappa was 0.830 and 0.731 for the two methods. The sensitivity and specificity of MDR by PLA method was 75.44% and 95.25% respectively, and the kappa value was 0.692. The mutant resistant strains of RFP mainly distributed in WT7, WT8 and MUT3 (S531L). Conclusion LPA method can detect RFP and INH drug resistance and other common resistant genes rapidly and accurately, which means it can sharply reduce the susceptibility test time for timely clinical drug treatment.

LPA; INH; RFP; drug resistance

10.3969/j.issn.1009-6663.2017.06.002

安徽省卫计委课题(No 15tb011)；安徽省胸科医院课题(No xk2015010)

230022 安徽 合肥，安徽省胸科医院检验科

王庆，E-mail：ahtbwangqing@163.com

2017-03-04]