QuEChERS/HPLC—MS/MS法同时测定果蔬中17种农药残留

郭保宝 石志格 刘胜男 张国庆 韩四海

摘要[目的]利用高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）检测技术，建立了果蔬中同时测定17种农药残留的分析方法。[方法]采用QuEChERS前处理方法，用含1%（V/V）乙酸的乙腈溶液提取样品，以无水硫酸镁（MgSO4）作为脱水剂，经N-丙基乙二胺（PSA）和石墨化碳黑（GCB）混合净化剂净化，C18色谱柱分离，高分辨质谱在正离子模式下选用多重反应监测（MRM）扫描测定，基质匹配标准曲线外标法定量。[结果]17种农药在1～50 ng/mL范围内线性关系良好，相关系数均在0.99以上。分别对黄瓜、苹果进行3个加标水平的回收试验（1.0、2.0、5.0 μg/kg），17种目标物的回收率为60.2%～117.7%，相对标准偏差低于12.8%。检出限（S/N≥3）为0.2 μg/kg，定量限（S/N≥10）为1.0 μg/kg。[结论]该方法简单、快速、灵敏、精确，能够同时准确测定果蔬样品中17种农药残留。

关键词QuEChERS；高效液相色谱-串联质谱；同时测定；果蔬；农药残留

中图分类号S481+.8文献标识码A文章编号0517-6611（2017）26-0087-06

Determination of 17 Pesticide Residues in Fruits and Vegetables by QuEChERS Method Coupled with High Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry

GUO Baobao1， SHI Zhige1，2， LIU Shengnan2 et al

（1. Sanmenxia Inspection and Quarantine Center， Sanmenxia， Henan 472000；2.Sanmenxia EntryExit Inspection And Quarantine Bureau of P.R. China， Sanmenxia， Henan 472000）

Abstract[Objective] A rapid and effective method was established for the simultaneous determination of 17 pesticide residues in fruits and vegetables by high performance liquid chromatography tandem mass （HPLCMS/MS）. [Method] Using modified QuEChERS method， the samples was extracted with acetonitrile containing 1% （V/V） acetic acid， purified by a mixed sorbent of MgSO4， primary secondary amine （PSA） and graphitized carbon black （GCB）， separated on a C18 column and analyzed by postitive electrospray ionization tandomd method. [Result] The results showed that the 17 pesticide residues were linear in the range of 1-50 ng/mL with correlation mass spectrometry under multiple reactions monitoring （MRM） mode.The quantitative analysis was used by external standarcoefficients（r） over 0.99. The recoveries at spiked levels of 1.0 ， 2.0 and 5.0 μg/kg for all target compounds in the samples were in the range of 60.2%-117.7%， with relative standard deviations less than 12.8%. The limits of detection （LOD， S/N≥3） was 0.2 μg/kg；the limits of quantitation （LOQ， S/N≥10） was 1.0 μg/kg. [Conclusion] A simple， rapid， sensitive and accurate method was developed， which was suitable for the determination of 17 pesticide residues in fruits and vegetables simultaneously.

Key wordsQuEChERS；High performance liquid chromatography tandem mass；Simultaneous determination；Fruits and vegetables；Pesticide residues

隨著经济的发展和人民生活质量的提升，食品安全问题越来越受到人们的重视[1-2]。水果和蔬菜含有大量丰富的维生素、人体必需的矿物质、水分和纤维质等营养物质，可以增强体质，提高免疫力，越来越受到人们的青睐。然而在种植过程中，为了预防病虫草害和提高产量，要使用各种不同的农药[3-4]。据估计，全世界每年因病、虫、草害造成的粮食损失约占总产量的50%，使用农药可挽回上述损失中的30%，其效益约为农药使用成本的4倍。但使用农药对生态环境、人类生命构成了巨大威胁。随着使用范围的逐渐扩大和使用量的不断增加，农药造成的环境污染和食品安全问题逐渐暴露，农产品农药残留超标现象常有发生。我国已制定了相关法律法规，针对具体的果蔬限制了农药的最大残留限量，而且标准要求越来越严格。因此建立高效、准确、选择性好的果蔬中农药残留检测方法尤为重要。

目前食品检测的前处理方法主要有固相萃取（SPE）[5-6]、固相微萃取（SPME）[7-8]、凝胶渗透色谱（GPC）[9-10]、分子印迹固相萃取（MI-SPE）[11-12]和QuEChERS方法[13-17]等。QuEChERS方法是美国农业部Anastassiades 教授在2003年研究开发的一种新型在水果、蔬菜中快速检测农药残留的前处理方法。QuEChERS方法与前几种方法相比，具有快速（quick）、简单（easy）、廉价（cheap）、有效（effective）、可靠（rugged）、安全（safe）等特点，是一种在农药残留分析中被广泛采用的样品前处理方法。

目前农药残留检测方法很多，主要有高效液相色谱法[18-19]、气相色谱法[20]、气相色谱-串联质谱法[21]、液相色谱-串联质谱法[22]。其中液相色谱-串联质谱法具有更高灵敏性、准确度和选择性，是目前多种农药残留分析中更为普遍采用的一种方法。笔者采用QuEChERS样品前处理方法，结合高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）技术，建立了水果蔬菜中17种农药残留同时检测的方法。该方法前处理样品简单、快速、溶剂使用量少、污染小，能够有效降低基质干扰，适用范围广，检测结果准确度和精确度高，适用于水果、蔬菜样品中多种农残组分的同时检测。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1原料及主要试剂。

水果、蔬菜样品，市售；甲醇（HPLC-MS级）、乙腈（HPLC-MS级），霍尼韦尔公司；无水硫酸镁、乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）粉、石墨化炭黑粉（GCB），购于美国安捷伦公司。17种农药标准品，购自Dr.公司或农业部标准物质中心。标准物质见表1。

1.1.2主要仪器设备。

6460液相色谱串联质谱仪，美国安捷伦公司；3-18K高速冷冻离心机，Sigma公司；R-210旋转蒸发仪，步琪公司；氮吹仪，上海安谱仪器公司。

1.2标准溶液的配制

准确称取10 mg（精确至0.01 mg）固体标准物质于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成1.0 mg/mL的标准储备溶液，-18 ℃保存。使用时根据需要用流动相初始比例配制成所需浓度的标准工作液，用于液相色谱及质谱条件优化。用空白样品基质溶液稀释标准工作液，制备基质匹配标准工作曲线。

1.3样品前处理方法

称取2 g（精确至0.001 g）样品于50 mL聚乙烯离心管中，加入2 mL超纯水，20 mL乙腈（含1%乙酸），涡旋混匀5 min。加入3 g氯化钠和2 g无水硫酸镁，混匀1 min，以4 000 r/min转速离心5 min。取15 mL上清液，加入100 mg PSA粉、100 mg GCB粉（视样品色泽而定）、100 mg无水硫酸镁，涡旋混匀后，以4 000 r/min转速离心5 min。取10 mL上清液，40 ℃氮吹至近干，用1 mL溶剂复溶后，过0.22 μm滤膜上机测试。

1.4色谱条件

色谱柱：Agilent Poroshell 120 EC-C18（2.7 μm，3.0 mm×100 mm）；流动相：A为0.1%（V/V）甲酸水溶液，B为乙腈，梯度洗脱程序见表2；流速0.3 mL/min；柱温30 ℃；进样量5 μL。

1.5质谱条件

电喷雾离子源（ESI），正离子模式，多反应监测（MRM）扫描；干燥氣温度325 ℃，干燥气流速6 L/min，雾化气压力310.26 kPa，鞘氣温度350 ℃，鞘气流速12 L/min；离子喷雾电压4 000 V；采用分段模式采集：第1段为 0～5.5 min，第2段为5.5～7.5 min，第3段为7.5～9.7 min，第4段为9.7～11.0 min，第5段为11.0～13.0 min。定性离子、定量离子、碰撞能量和碎裂电压见表3，17种农药标准品的总离子流色谱图见图1。黄瓜和苹果基质添加20 μg/kg混合标准溶液的总离子流色谱图分别见图2、3。

1.5.1定性测定。

在相同试验条件下进行样品测定时，如果样品中检出的色谱峰的保留时间与基质标准溶液中某种农药的色谱峰保留时间一致，并且在扣除背景后的样品质谱图中，所选择的离子均出现，并且所选择的离子丰度比与基质标准溶液的离子丰度比相一致（相对丰度>50%，允许±10%偏差；相对丰度在20%～50%，允许±15%偏差；相对丰度在10%～20%，允许±20%偏差；相对丰度≤10%，允许±50%偏差），就可判断样品中存在这种农药。

1.5.2定量测定。

采用外标-校准曲线定量测定。为减少基质的影响，采用基质匹配标准工作溶液，并且样品中农药的响应值在仪器的线性范围内。

45卷26期郭保宝等QuEChERS/HPLC-MS/MS法同时测定果蔬中17种农药残留

2结果与分析

2.1提取溶剂的选择

该试验比较了采用乙腈和含1%（体积比）乙酸的乙腈溶液对农药提取效率的影响。对17种农药在空白苹果基质中加标回收率进行比对，加标量为20 μg/kg，结果见表4。由表4可以看出，80%的目标农药采用乙腈提取与含1%乙酸的乙腈溶液的提取效果相当，而甲胺磷和氧乐果采用1%乙酸的乙腈提取效率有所增强。综合分析，含1%乙酸的乙腈溶液更适合于果蔬样品中多种农药的提取，因此，选择含1%乙酸的乙腈溶液作为提取溶剂。

2.2净化条件的优化

农药残留检测中常用的净化剂有PSA和GCB。PSA是一种固相吸附剂，在果蔬农残分析的前处理过程中被广泛应用，可以有效去除样品中的金属离子、有机酸等，对样品具有良好的净化作用，但是在去除色素、甾醇、维生素方面的效果不理想；而GCB在去除色素、甾醇、维生素等方面的能力较强，但由于其六元环结构会吸附对称结构及平面结构的农药，导致这些结构的农药的回收率降低，所以GCB的用量要依据样品色素含量决定，既起到净化作用，又不降低这类农药的回收率[23-25]。

该试验将水果、蔬菜样品分为两大类：一类是色素含量较少，提取液呈无色或颜色较浅，如苹果等；一类是色素含量较高，提取液颜色较深，如黄瓜等。通过试验发现，对于色素含量较少的样品，如苹果样品，净化过程中不加入GCB也可达到预期效果，不会对目标组分回收率产生影响。对于色素含量较高的样品，以黄瓜样品为例，只加入PSA，净化效果不好，需加入GCB除去大量色素，进而提高回收率。因此，采用空白基质加标回收法进行比较，加标量为10.0 μg/kg，分别考察了GCB用量为20、50、100、200 mg时对目标组分回收率的影响，结果见图4。从图4可以看出，当GCB用量为100 mg时，17种农药的平均回收率超过80%，且提取液较澄清透明，所以选择GCB用量为100 mg对样品进行净化。

2.3基质效应的考察

基质效应是分析农药残留时必须要考虑的问题。由于果蔬基质复杂，经过前处理净化后不能完全除去杂质，基质中杂质和挥发性组分会影响电喷雾接口处目标化合物的离子化效率。这些挥发性的基质组分将雾滴吸引在一起，阻止其裂解成为更小的微滴。根据接口处化合物的离子化和离子蒸发过程中的变化状况，这种竞争可能会阻碍或者增强被分析物质离子的形成，也就是平时所说的基质效应[26-30]。该试验采用基质标准溶液配制标准曲线，对检测结果进行校正。

该试验通过比對溶剂匹

配标准溶液和基质匹配标准溶液的信号差异来考察基质效应。采用20 ng/mL的基质匹配标准溶液（苹果基质）与相同浓度溶剂配制标准溶液的峰面积比例差异来考察基质效应，结果见表5和图5。由表5可知，17种农药响应信号都表现出了基质抑制效应。因此该方法采用基质匹配标准溶液作校准曲线来校正基质效应。

2.4复溶溶剂的考察

一般而言，为了减少溶剂效应并获得较好的峰形，液相色谱检测样品前处理时所使用的样品复溶溶剂多为初始流动相或者体积比接近初始流动相的溶剂。试验过程中发现，采用初始流动相（5%乙腈+95%含0.1%甲酸水溶液）作为复溶溶剂时，部分农药峰形不好，且回收率低，影响样品检测。因此，考虑试验中测定的目标农药数目较多，极性差别较大，所以比较了3种不同比例的复溶溶剂对试验结果的影响，分别为5%乙腈+95%含0.1%甲酸水溶液、50%乙腈+50%含0.1%甲酸水溶液、100%乙腈。试验结果发现，当复溶溶剂选择5%乙腈+95%含0.1%甲酸水溶液时，甲胺磷和氧乐果等极性较强、出峰时间较早的化合物峰形好，回收率高，而氯唑磷、马拉硫磷、灭线磷、腈菌唑、苯线磷、治螟磷、地虫硫磷和辛硫磷等保留时间靠后的化合物回收率低于50%。当复溶溶剂选择50%乙腈+50%含0.1%甲酸水溶液和100%乙腈时，对绝大多数目标农药复溶效果较好，回收率高且相对稳定，仅甲胺磷和氧乐果等极性较强的化合物出现溶剂效应，峰形变差且回收率低。原因可能是对于极性较强的化合物，如甲胺磷和氧化乐果等，其在高比例水相中溶解度较好，而在高比例有机相中溶解度变差，且出现溶剂效应，峰形变差、回收率低；极性较弱的化合物在高比例有机相中溶解度更好，回收率比较高且相对稳定。因此综合考虑，检测目标农药甲胺磷和氧乐果时选择复溶溶剂为5%乙腈+95%含0.1%甲酸水溶液，剩余15种目标农药选择50%乙腈+50%含0.1%甲酸水溶液作为复溶溶剂。

2.5方法学考察

2.5.1线性范围、检出限和定量限。

分别采用黄瓜空白基质提取液和苹果空白基质提取液作为标准溶液的稀释液，配制17种农药的基质匹配校准曲线，在已优化好的液相色谱-质谱条件下进行测定。以各目标化合物的定量离子峰面积为纵坐标，以化合物浓度为横坐标，绘制校准曲线，以定量离子3倍信噪比确定方法检出限（LOD），以定量离子10倍信噪比确定方法定量限（LOQ），结果见表6。由表6可以看出，17种农药在1～50 ng/mL范围内呈良好的线性关系，线性相关系数均大于0.99。检出限均为0.2 μg/kg，定量限均为1.0 μg/kg。

2.5.2回收率和精密度。

用阴性样品加标方法进行回收率

和精密度试验。分别对苹果样品和黄瓜样品进行3个水平

2.6实际样品检测

应用该试验所建立的分析方法，对苹果、梨、生菜、豆角、胡萝卜5份样品进行检测，检出目标农药1批次。研究表明，该方法可用于果蔬中17种农药残留的同时检测。

3结论

该试验采用QuEChERS净化技术与HPLC-MS/MS相结合，建立了一种快速、准确测定水果蔬菜中17种农药多残留分析方法。考察了不同的提取溶液、净化剂以及基质效应和复溶溶剂对回收率的影响。该方法简单、快速，具有良好的灵敏度、准确度，经方法学确认，适用于果蔬中多种农药残留的同时检测分析。

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