气相色谱内标法测定沙棘果肉油和种子油中的主要脂肪酸

杨明轩++周扬++陆俊++李贺

摘要：以5个沙棘（Hippopha？觕 rhamnoides L.）品种的果实为试材，建立气相色谱内标法测定沙棘果肉油和种子油主要脂肪酸成分的方法。果肉油和种子油采用氯仿-甲醇法提取，甲醇钠-甲醇法甲酯化衍生后进行定性和定量。结果表明，十九烷酸甲酯是气相色谱法测定沙棘果实中脂肪酸成分含量的理想内标物。果肉油和种子油中的主要脂肪酸为棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸、亚油酸和α-亚麻酸。果肉油中棕榈油酸（36.25%）和棕榈油酸（28.92%）含量高，α-亚麻酸含量低；种子油中亚油酸（33.65%）和α-亚麻酸（32.95%）含量高，棕榈油酸含量低。5个品种沙棘的果肉油和种子油中主要脂肪酸的组成及含量存在一定的差异。亚历山大12号果肉油中的脂肪酸含量最高，为84.84 g/100 g油；无刺丰种子油中的脂肪酸含量最高，为88.39 g/100 g油。该方法操作简便、快速、重复性好，适合沙棘油脂样品中脂肪酸的定量测定。

关键词：沙棘（Hippopha？觕 rhamnoides L.）；果肉油；种子油；脂肪酸；内标法；定量分析

中图分类号：S793.6；O657.7+1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）09-1734-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.09.033

Determination of Fatty Acids in Pulp Oil and Seed Oil from Sea Buckthorn by GC Internal Standard Method

YANG Ming-xuan，ZHOU Yang，LU Jun，LI He

（College of Environment and Resources， Dalian Minzu University， Dalian 116600， Liaoning，China）

Abstract： A gas chromatographic method for determination of fatty acids in pulp oil and seed oil was established with five cultivars of sea buckthorn berries as materials. The pulp oil and seed oil were extracted using chloroform-methanol method. The qualitative and quantitative analysis of fatty acids in oils were performed after they were methylated with CH3ONa-CH3OH. The results showed that methyl nonadecylate was optimal internal standard to analyse the contents of fatty acids in pulp oil and seed oil from sea buckthorn. The main fatty acids included palmitic，palmitoleic，stearic，oleic，linoleic and α-linolenic acids. In pulp oil，the contents of palmitoleic acid （36.25%） and palmitic acid （28.92%） were high and α-linolenic acid was few. In seed oil， the contents of linoleic acid（33.65%） and α-linolenic acid（32.95%） were high and palmitoleic acid was few. There were some differences in composition and content of main fatty acids among five cultivars. The pulp oil from Yalishanda-12 exhibited the highest content of total fatty acids at 84.84 g/100 g oil，respectively. The seed oil from Wucifeng contained highest total fatty acids at 88.39 g/100 g oil. The method is simple，effective and accurate for the fatty acid determination of sea buckthorn oil samples.

Key words：sea buckthorn（Hippopha？觕 rhamnoides L.）；pulp oil；seed oil；fatty acid；internal standard method；quantitative analysis

沙棘（Hippopha？觕 rhamnoides L.）又名酸刺、醋柳等，胡頹子科沙棘属多年生落叶灌木或小乔木，适应性强，耐干旱，盐碱，是中国重要的生态经济植物[1]。沙棘的果肉、种子和叶都含有油，即果肉油、种子油、叶油，其含油量受到基因型、生长环境、成熟时期等影响。通常所说的沙棘油主要指果肉油和种子油，二者富含不饱和脂肪酸，例如果肉油中有较多的棕榈油酸、油酸，种子油中的亚油酸和亚麻酸较多[2，3]。沙棘油经济价值极高，作为药用原料，广泛用于治疗烧伤、烫伤、冻伤等，对扁桃体炎、口腔炎、结膜炎等都有显著疗效，另外它还能调节免疫系统，对于心、脑血管系统疾病以及肿瘤、癌症等有预防作用[4，5]。

沙棘油中的脂肪酸组成及含量是衡量果实品质的一个重要指标。国内外针对沙棘油脂肪酸含量的检测主要集中于脂肪酸组分相对含量的测定[6-8]，而脂肪酸绝对含量测定的研究相对较少。本试验在进行内标物的选择和色谱条件的优化之后，建立了气相色谱内标法测定沙棘果肉油和种子油中脂肪酸的方法，促进了沙棘种质资源评价和综合开发利用。

1 材料与方法

1.1 材料

供试的5个沙棘品种（壮圆黄、无刺丰、柳沙1号、西伯利亚红晕、亚历山大12号）的成熟果实于2013年7月采自辽宁省阜新沙棘良种选育研究所（E121°28′，N42°26′），-50 ℃长期保存。

1.2 主要试剂、仪器

37种脂肪酸甲酯、棕榈酸甲酯、棕榈油酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯、亚油酸甲酯、亚麻酸甲酯和十九烷酸甲酯的分析标准品均购自Sigma-Aldrich（中国）公司，色谱纯级，纯度≥99%；氯仿、甲醇和正己烷购自美国Heonywell Burdick & Jackson公司，均为色谱纯级，纯度≥99%；甲醇钠，氯化钾为分析纯，购自生工生物工程上海（股份）有限公司。

GC-2010型气相色谱仪及工作站（日本SHIMADZU）；Labconco低温冷冻浓缩机（美国Labconco）；Mettler Toledo AB135-S型电子分析天平（瑞士 Mettler Toledo）；XW-80A微型旋涡混合仪（上海沪西分析仪器厂）。

1.3 方法

1.3.1 果肉油及种子油提取 取适量冷冻保存的沙棘果实真空冻干4 d（11 Pa，-53 ℃）。冻干后的果实放入研钵中，取出种子（自然风干后保存），倒入液氮快速研磨至粉末状，再次真空干燥1 d（11 Pa，-53 ℃），取出后-20 ℃保存。

果肉油的提取：取1 g果肉粉末于50 mL离心管中，加入10 mL甲醇搅拌混匀1 min，再加入20 mL氯仿搅拌混匀2 min，彻底混匀后过滤，残渣用20 mL的氯仿-甲醇（2∶1，V/V）重新悬浮，混匀后过滤，残渣用10 mL的氯仿-甲醇（2∶1，V/V）再悬浮，混匀过滤，收集滤液，加入1/4体积的0.88%的KCl，摇匀静置，分层后除去上层，对下层用1/4体积的甲醇-水（1∶1，V/V）洗涤，移去上层重复上一步骤，移去上层，将下层过滤，滤液于-20 ℃保存。

种子油的提取：取1 g风干种子，经液氮研磨成粉末，移到50 mL离心管内，余下步骤与果肉油提取方法相同。

1.3.2 样品的甲酯化 准确量取500 μL上述样品，参考Christie[9]的方法，采用甲醇钠-甲醇法对样品进行甲酯化处理。分析前向甲酯化的样品中加入500～1 000 μL含有1 mg/mL十九烷酸甲酯的正己烷，充分溶解后经0.45 μmL滤膜过滤待测。

1.3.3 色谱条件 色谱柱：Agilent-DB23色谱柱 （60 m×0.25 mm×0.25 μm）；柱箱：90 ℃；SPL1（进样口）：250 ℃；载气：高纯氮气 ；柱流量：0.8 mL/min；FID2（检测器）：270 ℃；分流比30∶1，进样量1 μL。柱箱升温程序：初始温度为90 ℃，以9 ℃/min的速度升温至190 ℃，再以3 ℃/min的速度升温至215 ℃，保持10 min，再以3 ℃/min的速度升温至230 ℃保持5 min，最后以3 ℃/min的速度升温至245 ℃保持5 min。

1.3.4 混标的配制及标准曲线的制定 称取适量棕榈酸甲酯、棕榈油酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯、亚油酸甲酯、亚麻酸甲酯标准品，用含有1 mg/mL十九烷酸甲酯的正己烷溶液分别配制成5、5、2、4、5、5 mg/mL的6种脂肪酸甲酯储备液。按表1的浓度梯度，取适当体积的每种储备液，用含有浓度为1 mg/mL正己烷（19∶0）的溶液定容，配制8组脂肪酸甲酯的混合标准品（混标）。根据果肉和种子中脂肪酸的组成特点，选择适合的浓度范围，应用GCsolution工作站内标法制定每种脂肪酸甲酯相应的标准曲线。

1.3.5 数据统计分析 按上述色谱条件，根据标准样品的保留时间和峰面积对样品进行定性定量。采用SPSS 22.0软件进行单因素方差分析和差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的确定及内标物的选择

图1是37种脂肪酸甲酯标准品的总离子流色谱情况，在该色谱条件下，37种脂肪酸甲酯混合标准品显示出较好的分离效果，其出峰时间在6～45 min之内，可用于待测沙棘油中脂肪酸成分的定性。

如图2和图3所示，沙棘果肉油和种子油中所有的脂肪酸甲酯显示出较好的分离效果和较高的信号响应，与37种脂肪酸甲酯混标的出峰时间一致性高。利用GCsolution软件将样品的总离子流与37种脂肪酸甲酯混标的色谱图进行比对后定性。根据出峰时间、峰高和峰面积可判断，沙棘果肉油和种子油中的主要脂肪酸包括棕榈酸（C16：0）、棕榈油酸（C16：1）、硬脂酸（C18：0）、油酸（C18：1c）、亚油酸（C18：2c）和α-亚麻酸（C18：3n3）6種，集中在20～30 min被分离，但它们在果肉油和种子油中的组成有所不同。

植物油脂中脂肪酸的定量常以十五烷酸及其甲酯、十七烷酸及其甲酯作为内标物，也有用十三烷酸及其甲酯作为内标物。但由图2和图3可见，上面提到的内标物不适于本试验。在柳沙1号沙棘的果肉油和种子油中，均检测出了十五烷酸（15：0）和十七烷酸（C17：0），前者在果肉油和种子油中为微量，出峰时间大约在19 min；后者在果肉油中含量稍高，种子油中为痕量，出峰时间大约在22 min。另外，沙棘果肉和种子中的主要脂肪酸为16碳和18碳脂肪酸，出峰时间集中在20～30 min，十三烷酸甲酯作为内标物出峰时间距离这一范围较远，不是理想的内标物。图4为供试样品不加十九烷酸甲酯和加入十九烷酸甲酯作为内标物的对比色谱。十九烷酸甲酯的出峰时间在被测物出峰范围之内，且与被检测物分离效果明显，不与已知脂肪酸甲酯反应，可以有效起到内标物的作用，表明其是理想的脂肪酸定量的内标物。因此本试验选择沙棘果肉油和种子油中均未检测到的十九烷酸甲酯作为脂肪酸定量所用内标物。

2.2 线性关系与重现性

图5是6种脂肪酸甲酯混合标准品加/未加内标物的色谱情况，以標准品与内标物的峰面积比为横坐标（x），以标准品与内标物的质量浓度比为纵坐标（y），进行线性回归分析。配制的内标物十九烷酸甲酯的正己烷溶液浓度为1 mg/mL，所有的脂肪酸甲酯混标和甲酯化的待测样品均用此溶液溶解后检测，因此，y即代表每种脂肪酸甲酯的质量浓度。根据所测样品的浓度范围建立相应的标准曲线，结果见表2和表3。果肉油中6种主要脂肪酸的线性回归方程的相关系数在0.999 1～0.999 8；种子油中6种主要脂肪酸的线性回归方程的相关系数在0.994 2～0.999 8，表明在设定的气相色谱条件下6种脂肪酸组分的峰面积与其含量有较好的线性相关性，试验方法能在给定的浓度范围内准确地测定脂肪酸组分的含量。

对回收率的测定本研究采用加标回收法，各取3份等体积的已知质量浓度的果肉油和种子油甲酯化样品，分别加入不同质量的6种脂肪酸甲酯标准品，使果肉油中棕榈酸甲酯和棕榈油酸甲酯的质量浓度增加1.0 mg/mL，油酸甲酯和亚油酸甲酯的质量浓度增加0.4 mg/mL，硬脂酸甲酯和α-亚麻酸甲酯质量浓度增加0.1 mg/mL；使种子油中亚油酸甲酯和α-亚麻酸甲酯的质量浓度增加1.0 mg/mL，油酸甲酯和棕榈酸甲酯的质量浓度增加0.50 mg/mL，硬脂酸甲酯和棕榈油酸甲酯的质量浓度增加0.1 mg/mL，根据每种标准品的加入量和检出量计算其回收率。另外，检测6份平行处理得到的样品，计算测定结果的相对标准偏差，以考察试验方法的重复性。方法的回收率结果和相对标准偏差见表2和表3。在所选择的方法和条件下，果肉油和种子油主要脂肪酸定量分析的回收率分别在在92.4%～101.2%和92.7%～102.3%，符合试验要求。二者被测定脂肪酸的相对标准偏差均小于4.0%，说明方法重复性好。

2.3 不同品种沙棘果肉油与种子油中脂肪酸组成及含量的测定

由表4可知，5个品种沙棘果肉油的主要脂肪酸成分中棕榈油酸和棕榈酸含量较多，分别占36.25%和28.93%；其次是油酸（15.29%）和亚油酸（12.27%）；硬脂酸（4.52%）和α-亚麻酸（2.75%）含量较少。不饱和脂肪酸含量占66.56%，多不饱和脂肪酸（亚油酸和α-亚麻酸）占15.02%。果肉中棕榈油酸比棕榈酸含量稍高，在24.02～32.56 g/100 g油之间，棕榈酸的含量在14.36～26.33 g/100 g油之间，二者含量最高的品种是柳沙1号，达到58.89 g/100 g油。油酸和亚油酸的平均含量分别为（14.26±2.25）和（9.32±1.77） g/100 g油。果肉中只含有微量的α-亚麻酸，平均为（2.09±0.65） g/100 g油。果肉油中主要脂肪酸含量高的品种是亚历山大12号和柳沙1号，分别为84.84 g/100 g油和84.15 g/100 g 油，含量较高的是壮圆黄和无刺丰，分别为75.91 g/100 g和74.18 g/100 g油，西伯利亚红晕最低，为60.62 g/100 g油。5个品种沙棘果肉油中6种主要脂肪酸的平均含量从大到小依次排列为棕榈油酸>棕榈酸>油酸>亚油酸>硬脂酸>α-亚麻酸。

5个品种沙棘种子油中的主要脂肪酸含量的比较分析结果如表5所示。其中不饱和脂肪酸的含量明显高于果肉油，占83.41%，多不饱和脂肪酸占66.27%，两种多不饱和脂肪酸亚油酸和α-亚麻酸在种子中含量较多，分别占33.65%和32.95%；其次是油酸，占15.50%，棕榈油酸含量最低，仅占1.32%。不饱和脂肪酸含量明显高于果肉油。5个沙棘品种的种子中亚油酸的含量在25.73～30.75 g/100 g油，α-亚麻酸在19.97～29.89 g/100 g油，二者含量最高的是无刺丰品种，达60.64 g/100 g油，油酸的平均含量为12.77 g/100 g油，棕榈酸的平均含量为9.81 g/100 g油，硬脂酸的平均含量为3.85 g/100 g油，棕榈油酸为微量，平均1.09 g/100 g油。种子油中主要脂肪酸含量最大的品种是无刺丰，为88.39 g/100 g油，其次为壮圆黄、柳沙1号和亚历山大12号，分别为85.85、84.77和81.84 g/100 g油，西伯利亚红晕最低，为71.06 g/100 g油。沙棘种子油中6种主要脂肪酸的平均含量从大到小依次排列为：亚油酸>α-亚麻酸>油酸>棕榈酸>硬脂酸>棕榈油酸。

3 小结与讨论

色谱分析的内标物应与被测组分的相对分子质量和沸点相近、结构相似，且保留时间相近，但又能分开。已报道的植物油脂分析用气相色谱的内标物有十三烷酸甲酯[10]、十五烷酸甲酯[11]、十七烷酸甲酯[12]，陈云峰等[13]曾采用十九烷酸甲酯为内标测定了生物柴油中的脂肪酸甲酯及亚麻酸甲酯含量。本研究中，供试沙棘品种果肉油和种子油的脂肪酸成分经定性后发现含有少量或微量的十五烷酸和十七烷酸，与Singh等[8]在印度沙棘品种中的发现相一致，从而使得十五烷酸甲酯和十七烷酸甲酯无法作为定量的内标物，而十三烷酸甲酯出峰时间距离待测脂肪酸较远，故选择十九烷酸甲酯为内标物进行定量分析。按照优化的色谱条件，待测成分及内标物分离效果良好，验证了十九烷酸甲酯是定量分析沙棘油脂肪酸的理想内标物。

试验测得的沙棘果肉油和种子油中主要脂肪酸的成分与前人的报道基本一致[6，7]，包括棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸、亚油酸和α-亚麻酸。6种脂肪酸在果肉油和种子油中的组成差异较大，果肉油中棕榈油酸和棕榈酸含量高，亚麻酸含量最低；种子油中亚油酸和α-亚麻酸含量高，棕榈油酸含量最低。沙棘果肉油和种子油中的脂肪酸组成与遗传、地理环境、气候条件、成熟期等有关，其中遗传是关键影响因素。本研究中的5个沙棘品种生长环境相同，均为成熟期采摘，其果实中不同部位（果肉和种子）脂肪酸的的组成和含量存在较大的差异，主要与基因型和遗传有关。果肉油中主要脂肪酸的总量大小顺序为亚历山大12号>柳沙1号>壮圆黄>无刺丰>西伯利亚红晕；种子油中主要脂肪酸的总量大小顺序为无刺丰>壮圆黄>柳沙1号>亚历山大12号>西伯利亚红晕。

本研究首次建立了以十九烷酸甲酯为内标的气相色谱法测定沙棘油脂肪酸的方法，为沙棘油脂肪酸的绝对含量提供了有效的方法，有助于沙棘油脂肪酸的精确检测和深度开发。

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