胀果甘草查尔酮异构酶基因的克隆及序列分析

尹彦超，张晓冬，马永生，周姗，高智强，胡婷，刘颖

北京中医药大学 中药学院，北京 100102

胀果甘草查尔酮异构酶基因的克隆及序列分析

尹彦超，张晓冬，马永生，周姗，高智强，胡婷，刘颖

北京中医药大学 中药学院，北京 100102

目的：对胀果甘草甘草苷生物合成途径的关键酶查尔酮异构酶（CHI）进行基因克隆及序列分析。方法：根据乌拉尔甘草CHI基因cDNA序列设计引物，以胀果甘草主根总RNA为模板RT-PCR扩增CHI基因cDNA序列，并对其进行分析。结果：克隆得到20条胀果甘草CHI基因cDNA序列，开放读框全长690 bp，编码229个氨基酸残基。20条胀果甘草CHI基因的cDNA序列存在22个变异位点，一致性为99.54%，可分为6种单倍型；其编码的氨基酸序列存在14个变异位点，一致性为98.98%。胀果甘草CHI基因编码蛋白为稳定性亲水蛋白，相对分子质量为24.5×103，等电点为5.3～6.2，不含信号肽，无跨膜区，二级结构以α螺旋和无规则卷曲为主，保守结构域包含一个查耳酮超家族结构域。同源性分析显示，不同物种间的CHI基因同源性较低。结论：克隆了胀果甘草CHI基因cDNA序列，为进一步研究不同基原甘草中甘草苷生物合成的分子调控机制奠定了基础，并为优质甘草的分子选育提供了理论依据。

胀果甘草；查尔酮异构酶；生物信息学分析

［Key words］Glycyrrhiza inflataBat.;chalcone isomerase;bioinformatic analysis

甘草是我国最常用的大宗药材之一，具有补脾益气、抗炎解毒、镇咳祛痰、调和诸药等作用[1]。《中国药典》规定的甘草基原是豆科植物乌拉尔甘草（Glycyrrhiza uralensisFisch.）、胀果甘草（G.inflataBat.）或光果甘草（G.glabraL.）的干燥根和根茎[1]。乌拉尔甘草、光果甘草、胀果甘草虽然同为药典采用的甘草基原植物，但其化学成分和药理活性却相差较大[2-3]。目前关于甘草的研究多集中于乌拉尔甘草，涉及功能基因克隆[4]、基因多态性研究[5]、化学成分分析[6]等方面，而关于胀果甘草的研究报道则相对较少。

甘草的活性成分主要为甘草酸和甘草苷，《中国药典》规定本品按干燥品计算，含甘草苷（C21H22O9）不得少于0.50%[1]。甘草苷属于黄酮类化合物，其生物合成途径受众多酶的调控，其中查耳酮异构酶（chalcone isomerase，CHI）是关键酶之一，催化分子内的环化反应[7]，对甘草苷的合成具有至关重要的作用。CHI分为2种类型，Ⅰ型CHI只能以查耳酮为底物，催化柚皮素查尔酮合成柚皮素；Ⅱ型CHI既可以查耳酮为底物，也可以6'-脱氧查耳酮为底物[8]，催化查尔酮类的异甘草素合成甘草素，甘草素与α-D-吡喃葡萄糖合成甘草苷（图1）。因此，对CHI开展相关研究，可以在一定程度上揭示甘草苷生物合成的分子机制，从而有望提高栽培甘草中甘草苷的积累水平。

鉴于CHI在黄酮代谢途径中的关键地位，目前已从金银花[9]、水母雪莲[10]、芍药[11]等植物中克隆得到其cDNA序列。就甘草而言，3种基原甘草中乌拉尔甘草CHI基因cDNA序列已有报道[12]，而胀果甘草中该基因尚未完成克隆。因此，我们采用RT-PCR技术，以胀果甘草主根总RNA为模板克隆CHI基因，并进行序列比对及生物信息学分析，为进一步研究功能基因多态性对甘草苷积累的影响及优质甘草的分子育种奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

植物材料取自栽培两年生的新鲜胀果甘草主根，液氮速冻，-80℃保存备用。大肠杆菌DH5α感受态细胞、pMD-19T载体、ESPY spin植物RNA快速提取试剂盒、琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒、M-MLV（Rnase H-）购于北京博迈德生物技术有限公司；LA-TaqDNA聚合酶、Oligo（dT）购于TaKaRa公司；引物合成由上海生工生物工程公司（Sangon）完成。微量移液器（Eppendorf）；1-13000型离心机（Sigma）；DYY-6C型电泳仪（北京六一仪器厂）；BG-gdsAUTO510型凝胶成像系统（上海培清科技有限公司）；酶标仪（Biotek Epoch）。

1.2 胀果甘草主根总RNA的提取及RT-PCR

取胀果甘草根于液氮中研磨至粉末，用RNA提取试剂盒提取总RNA，1.0%琼脂糖凝胶电泳检查RNA的完整性，用酶标仪测定所得RNA的纯度和浓度。以胀果甘草总RNA为模板，Oligo（dT）为引物，用M-MLV反转录试剂盒反转录成cDNA。

1.3 胀果甘草CHI基因扩增

根据文献[12]报道的乌拉尔甘草CHI序列，用Primer Premier 5.0设计上游引物GF（5'-ATGGC GGGAGCAGCACCAGTA-3'）和下游引物GR（5'-T CAGTTTCCGTTTCCAAT-3'），以上述反转录合成的cDNA为模板进行PCR扩增。50μL反应体系包括模板cDNA 2.0μL、10×缓冲液5.0μL、dNTP（2.5 mmol/L）5.0μL、引物GF和GR（10μmol/L）各2.0μL、LA-TaqDNA聚合酶1.0μL、无RNase的水33.0μL。反应程序：95℃ 2 min；95℃ 20 s，58℃ 30 s，72℃ 45 s，35个循环；72℃ 5 min。于4℃保存。

1.4 PCR产物胶回收、克隆及序列测定

经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测后，切下目的片段，胶回收纯化后与pMD-19T于16℃连接12 h，将连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂于含50 mg/L氨苄西林（Amp）的LB固体培养基上，37℃倒置培养12～16 h，随机挑选50个单菌落接种于含50 mg/L Amp的LB液体培养基中，于37℃、200 r/min条件下培养 12～16 h，行菌液PCR，1.0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，验证为阳性克隆的用于测序。测序由上海生工生物工程有限公司完成。

1.5 生物信息学分析

将得到的序列在NCBI网站进行BLAST比对。用Editseq将所得序列翻译成氨基酸序列，通过 在 线 工 具 SignaIP、Prot Scale、Prot Param、SW ISS-Model和SOPMA等分析其二级结构、三级结构、信号肽、跨膜结构域、保守结构域及基本理化性质，并通过NCBI在线数据库查找已注册的CHI序列，用软件MEGA5.1构建系统进化树。

2 结果

2.1 胀果甘草CHI基因序列分析

图1 甘草苷合成途径

共获得20条长度约为690 bp的胀果甘草CHI基因cDNA序列（图2），与目标条带长度一致。测序结果显示，所得20条cDNA序列长度均为690 bp。DNAMAN比对结果显示20条cDNA序列中存在22个变异位点，可分为6种单倍型J1～J6，一致性为99.54%（表1）。将这6种单倍型与文献[12]报道的乌拉尔甘草CHI基因cDNA序列进行比对，发现其一致性为98.55%～100%，因此可确定获得的序列为胀果甘草CHI基因cDNA序列。氨基酸序列比对结果显示存在14个变异位点，一致性为98.98%（表2）。在GenBank完成所有序列的注册，注册登录号见表3。在两两比对时发现J3与J1、J2、J4、J5、J6之间的一致性分别为99.86%、98.55%、99.13%、99.42%和99.86%，较其他高；J2与J1、J3、J4、J5、J6之间的一致性分别为98.41%、98.55%、97.68%、97.97%和98.41%，较其他低。因此，挑选这2条序列进行后续生物信息学分析。

2.2 理化性质分析

用ProtParam软件预测6条胀果甘草CHI编码蛋白的理化性质，结果见表3。胀果甘草CHI编码的蛋白由229个氨基酸残基构成，相对分子质量约24.5×103，等电点为5.3～6.2，不稳定指数均小于40，表明其为稳定蛋白，半衰期为30 h。总平均亲水性为-0.125～-0.040，均为负值且介于-2.0～2.0，说明胀果甘草CHI为亲水性蛋白。

图2 CHI扩增结果

2.3 胀果甘草CHI的同源性分析

利用DNAMAN将所得6条胀果甘草CHI氨基酸序列与其他植物的该氨基酸序列进行同源性比较，结果表明胀果甘草J3与文献[12]报道的乌拉尔甘草一致性最高，为 100%；其次与绿豆（AJZ72654.1）的一致性较高，为76.42%；而与拟南芥（OAP11712.1）的一致性最低，仅为7.48%。J2与文献[12]报道的乌拉尔甘草一致性最高，为97.38%；其次为绿豆（AJZ72654.1），74.67%；与拟南芥（OAP11712.1）的一致性最低，仅为7.14%。可见CHI在不同物种间的同源性较低。

根据亲缘关系的远近，在NCBI数据库中挑选有代表性的20个其他物种的CHI序列，利用MEGA5.1软件，将其与本研究所得胀果甘草CHI氨基酸序列构建Neighbor-Joining系统进化树，如图3所示。27条氨基酸序列共分为2大类群，其中6条胀果甘草CHI序列与文献报道的乌拉尔甘草聚到一支，且与豆科植物绿豆（AJZ72654.1）在进化关系上最近，与枸杞（AIC33515.1）、郁金香（AGJ50586.1）、紫花苜蓿（AGZ04578.1）等较远，与拟南芥（OAP11712.1）、黄芩（AMW 91737.1）等相距更远，该结果与序列分析结果相符。

2.4 胀果甘草CHI二级结构预测

用DNAMAN和SOPMA对J3和J2的二级结构进行预测，结果如图4。J3由34.06% α螺旋、21.40%延伸链、11.79% β折叠、32.75%不规则卷曲组成；J2由31.44% α螺旋、20.09%延伸链、11.79% β折叠、36.68%不规则卷曲组成。J3与J2在29～140、175～218位均存在α螺旋，30～34、163～167、222～224位均存在β折叠，123～127、142～145、159～160位为延伸链，35～38、88～91、105～107、172～174位为不规则卷曲，由此可推断两者在氨基酸二级结构上相近。

2.5 胀果甘草CHI结构域分析及三级结构预测

表1 胀果甘草CHI基因cDNA序列变异位点统计表

对J3、J2进行结构域分析，结果显示均包含一个查尔酮3超家族结构域。采用SWISS-Model分别对J3和J2进行蛋白质三级结构同源性建模，结果如图5所示，以X-ray为方法，1jx1.1.A为模板建立的J3模型和J2模型立体结构相似。2.6 胀果甘草CHI信号肽的预测及分析

表2 胀果甘草CHI氨基酸序列变异位点统计表

用SignalP 4.1 Server对J3、J2进行信号肽预测，结果如图6。J3序列中第24位氨基酸残基具有最高的原始剪切位点分值0.116，第2号氨基酸残基具有最高的信号肽分值0.154，第11号氨基酸残基具有最高的综合剪切位点分值0.119。J2序列中第9位氨基酸残基具有最高的原始剪切位点分值0.109，第2号氨基酸残基具有最高的信号肽分值0.131，第12号氨基酸残基具有最高的综合剪切位点分值0.106。由此可见，胀果甘草CHI不存在信号肽酶切位点，不具有信号肽。

2.7 胀果甘草CHI跨膜结构域的预测

表3 胀果甘草CHI氨基酸序列理化性质

图3 CHI系统进化树图

图4 胀果甘草CHI二级结构预测

用TMHMM Serber v.2.0对胀果甘草CHI氨基酸序列的跨膜结构域进行预测，结果如图7。J3、J2序列均不存在跨膜结构域，这也与它们的亲水性较高相符。由此可推断胀果甘草查尔酮异构酶无跨膜区，存在于膜外。

3 讨论

近年来因过度采挖，已造成野生甘草濒临灭绝的现象[13]。目前市售甘草药材多为栽培甘草，因此对栽培甘草的合理利用和有效开发尤为重要。本课题组前期研究显示栽培甘草中甘草苷的含量普遍偏低，难以达到药典标准。因此，对甘草苷生物合成途径中的关键酶开展相关研究，有可能揭示甘草苷生物合成的分子机制，从而提高栽培甘草中甘草苷的累积水平，是中药现代化的具体表现，也是保护和发展中国传统道地药材的基础性工作。

图5 胀果甘草CHI三级结构预测

图6 胀果甘草CHI信号肽预测

图7 胀果甘草跨膜结构域预测

我们用RT-PCR方法克隆了胀果甘草CHI序列，获得6种单倍型，比对分析后发现其cDNA序列虽不完全相同，但是其蛋白的理化性质、二级及三级结构等差异较小，且均包含一个查尔酮3超家族结构域，无信号肽和跨膜区。由此推断cDNA序列单核苷酸多态性对其编码酶的功能影响较小。分析显示CHI在不同物种间同源性相对较低，因此这可能给同源克隆带来一定的难度。

CHI广泛存在于多种植物中，它是黄酮代谢途径中的关键酶，其表达量的多少直接影响着金银花颜色的形成[9]；并在葡萄果皮、种子和果肉发育过程中有利于花青素的积累，对葡萄的质量和营养价值有重要意义[14]。除此之外，Verhoeyen等通过异位表达查尔酮异构酶，得到了总黄酮醇含量增加48倍的番茄[15]；Lukaszewicz等将查尔酮合成酶基因导入马铃薯块茎，基因的过表达引起了黄酮类化合物的增加，改善了马铃薯的抗氧化能力[16]。本研究克隆得到6种胀果甘草CHI单倍型，将有利于进一步探讨甘草中黄酮类物质生物合成的分子调控机制以及提高甘草质量。

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Cloning and Sequence Analysis of Chalcone Isomerase Gene from Glycyrrhiza inflata Bat.

YIN Yan-Chao,ZHANG Xiao-Dong,MA Yong-Sheng, ZHOU Shan,GAO Zhi-Qiang,HU Ting,LIU Ying*

School of Chinese Pharmacy,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100102,China

*Corresponding author,E-mail:liuyliwd@.sina.com

Objective:To clone and analyze the chalcone isomerase（CHI）gene fromGlycyrrhiza inflataBat..Methods:Specific primers were designed based on reportedCHIcDNA sequence ofG.uralensis,RT-PCR technique was used to amplifyCHIcDNA sequences ofG.inflata,and which were analyzed by bioinformatics.Results:TwentyCHIcDNA sequences ofG.inflatawith the length of 690 bp were obtained encoding 229 amino acid residues.Twenty-two variable sites were found in these 20 cDNA sequences and 6 haplotypes were determined,with a similarity of 99.54%.Physicochemical property ananlysis shows that theseCHIcoding protiens are all stably hydrophilic protein,with a molecular weigh of 24.5 kD and a isoelectric point between 5.3～6.2.It has no signal peptides or trans membrane domains.Its secondary structure mainly consists of alpha helix and random coil.Also chalcone super family domain is included in the conserved domain.Homology analysis indicates that the homology ofCHIamong different species is low.Conclusion:CHI cDNA sequeces were successfully cloned fromG.inflata.We hope this work will lay a foundation for further researches on the molecular mechanisms of flavonoid biosynthesis in different licorice origins and licorice molecular breeding.

Q943.2

A

1009-0002（2017）03-0274-07

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.03.007

2016-11-25

北京中医药大学杰出青年人才项目（2016JYBXJQ002）

尹彦超（1993-），男，硕士研究生，（E-mail）yinyanc_pharm@sina.com

刘颖，（E-mail）liuyliwd@.sina.com