中华鳖gp130基因全长cDNA克隆及生物信息学分析

宋如昕，王兰，张左兵

山西大学 生命科学学院，山西 太原 030006

中华鳖gp130基因全长cDNA克隆及生物信息学分析

宋如昕，王兰，张左兵

山西大学 生命科学学院，山西 太原 030006

目的：从中华鳖脾脏、肝脏、肠道构建的SMART cDNA文库中克隆中华鳖gp130基因cDNA全长。方法：采用RACE法克隆中华鳖gp130基因全长cDNA，并对其进行生物信息学分析。结果：中华鳖gp130基因cDNA全长3806 bp，对应基因组全长73 252 bp，包含16个内含子及17个外显子。中华鳖gp130与鸟类、哺乳类相比均有保守的共线性关系。该基因编码由927个氨基酸残基构成的序列，二级结构主要包括α螺旋、延伸链、无规则卷曲、β转角，三级结构包含配体结合、跨膜结构域、纤维链接蛋白结构域等。系统进化分析显示与鸟类首先聚类，其次是哺乳类，最后是两栖类与鱼类。同时以人GP130蛋白为模型构建了中华鳖GP130蛋白的3D结构模型，一致性为58.32%。结论：获得了中华鳖gp130基因全长并做了生物信息学分析，为深入研究GP130及相关信号通路提供了基础。

中华鳖；糖蛋白130（GP130）；cDNA末端快速扩增（RACE）

JAK-STAT信号通路是近年研究较热的一条由细胞因子刺激的信号转导通路，参与细胞的增殖、分化、凋亡及免疫调节等许多重要的生物学过程[1]。在此信号通路中，糖蛋白130（glycoprotein 130，GP130）［又称白细胞介素6信号转导因子（IL-6 signal transducer，IL6st）］是白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）、白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）、抑瘤素 M（oncostatin-M，OSM）、睫状神经营养因子（ciliary neurotrophic factor，CNTF）、白细胞介素11（IL-11）等因子共用的受体和信号转导因子[2]。GP130既可以膜型形式整合在机体的细胞膜上，又能以可溶性蛋白的形式分布于体液中，该蛋白在JAK-STAT信号通路的调控中起重要作用[3]。

有关GP130及相关信号通路的研究主要集中于哺乳动物。在肿瘤发生方面，Greten小组发现该基因的第757号酪氨酸至苯丙氨酸的点突变（gp130Y757F）会引起STAT3的超活化，这一位点突变的转基因小鼠在氧化偶氮甲烷/葡聚糖硫酸钠（AOM/DSS）的诱导下发生肠道肿瘤的比例明显升高[4]。GP130蛋白可激活多个下游信号通路，如可磷酸化激活STAT转录因子，尤其是STAT3，激活的STAT3二聚体化，转移至细胞核中，激活下游基因的转录；此外，还可引起酪氨酸磷酸酶SHP2聚集并激活下游基因Ras/Erk（胞外信号调节激酶）和PI3K（磷酸肌醇3激酶）信号通路[5-6]。免疫功能方面，可参与炎症反应，如对过敏性哮喘患者的外周血检测发现GP130异常增高[7]。IL-6/IL-6R/GP130激活STAT3的信号途径在Th17细胞的分化过程中起重要作用，GP130信号通路在Th17的诱导中是必需的[8]。另外，在小鼠中的最新研究发现，肝细胞中IL-6-GP130-STAT3信号通路在T细胞介导的肝脏炎症中起到一定的保护作用[9]。河豚中，IL-6可与IL-6R/GP130复合体结合，从而激活JAK-STAT3信号通路，促进IgM的产生[10]，在斑马鱼的研究中也发现gp130转录在鱼体发育的早期就已产生，且在鱼体前后轴线上均能检测到，分布较广泛[11]。但在进化上有重要过渡作用的爬行类中却鲜有gp130的研究报道。中华鳖作为研究较多的爬行类物种，是我国重要的水产养殖品种[12]，广泛分布于长江流域及华南地区[13]。故而中华鳖gp130基因的克隆及相关分析，对研究爬行动物免疫尤其是JAK-STAT3信号通路具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

实验用中华鳖购自河北省玉田县中华鳖良种场。于实验室驯化2周，期间每日饲喂商品化饲料一次并换水，水温维持在（25±1）℃。实验时，断头处死中华鳖，快速分离脾脏、肝脏、肠道组织，液氮速冻，保存于-80℃备用。

1.2 总RNA提取及反转录合成cDNA第一链

采用TRIzol法提取总RNA[14]。将-80℃保存的组织样品取出，加入1 mL TRIzol（Invitrogen公司），组织匀浆，室温静置5 min，离心（12 000×g，5 min，4℃）；取上清，加入1/5体积的氯仿，涡旋15 s，室温静置5 min，离心（12 000×g，15 min，4℃）；取上清转移到新的无RNA酶的离心管中，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，室温静置10 min，离心（12 000×g，10 min，4℃）得到RNA沉淀。沉淀用75%乙醇洗涤2次，室温干燥5～10 min，待干燥后，加入DEPC处理的去离子水，55℃溶解10 min，冰浴20 min，分光光度计（Eppendorf公司）测量总RNA的浓度。1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量。按照SMARTer RACE cDNA扩增试剂盒（TaKaRa公司）操作手册，将提取的脾脏、肝脏、肠道RNA混合后用于合成3'-与5'-RACE-ready cDNA文库。

1.3 gp130全长cDNA的克隆

根据自NCBI数据库中得到的中华鳖gp130基因预测序列设计引物，由上海生工公司合成（表1），按照SMARTer RACE cDNA扩增试剂盒操作说明，进行5'和3'RACE，从中华鳖cDNA文库中扩增gp130的3'与5'端片段。其中，UPM与NUP为通用引物。按照普通PCR反应进行扩增。PCR产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳分离检测后，切胶回收相应的目的片段，克隆到pMD19-T simple（TaKaRa公司）载体上，连接产物转化DH5α大肠杆菌，挑单克隆培养，PCR筛选阳性克隆送上海生工公司测序，将测序结果进行BLAST比对并拼接全长，依此拼接序列设计gp130全长cDNA验证引物，经PCR及测序验证后获得cDNA全长序列。

表1 实验所用引物序列及用途

1.4 生物信息学分析

用BioEdit 7.2.3软件对中华鳖gp130cDNA片段进行拼接、分析，并利用在线翻译软件Ex-PASy Translate（http://web.expasy.org/translate/）将gp130序列翻译为氨基酸序列。各个脊椎动物基因结构及共线性关系通过搜索Ensembl数据库（http://asia.ensembl.org/index.htm l）得到。中华鳖和其他脊椎动物的氨基酸序列多重比对采用ClustalX1.8 软件结合 BoxShade（http://www.ch.embnet. org/software/BOX_form.htm l）在线软件完成，并在MEGA 6.06软件中用邻接法进行进化树构建（自举检验1000次）。用到的其他物种的氨基酸序列均来自GenBank。采用SOPMA（https://npsa-prabi. ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）在线软件预测蛋白质二级结构，蛋白3D结构预测采用同源建模法，用SWISS-MODEL（http:// swissmodel.expasy.org）在线软件完成。同时，结合SMART在线软件（http://smart.embl-heidelberg.de/）预测蛋白三级结构。

2 结果

2.1 中华鳖gp130基因全长获得及序列分析

经过3'及5'RACE，分别获得中华鳖gp130基因的3'及5'cDNA片段，经全长PCR验证，获得了3.5 kb左右的惟一条带（图1）。将片段切胶回收，连接到pMD19T simple载体，送上海生工公司测序，将测序结果与NCBI数据库进行BLAST比对确定为中华鳖gp130基因。序列分析表明基因全长为3806 bp，开放读框长度为2784 bp，编码927个氨基酸残基，5'非翻译区（UTR）长度为90 bp，3'UTR长度为936 bp（图2）。分析显示中华鳖GP130包含WSXWS（色氨酸-丝氨酸-X-色氨酸-丝氨酸）序列、血细胞生成素受体序列，氨基酸序列末端还具有STAT3结合位点等（图2）。

2.2 中华鳖gp130基因结构分析与共线性关系分析

通过搜索Ensembl数据库中中华鳖的基因组序列，并结合克隆得到的中华鳖gp130基因cDNA序列，我们获得了该基因的结构示意图。对应的基因组全长为73 252 bp，包含17个外显子、16个内含子。图3为中华鳖gp130基因的基因结构。

根据Ensembl数据库获得的基因相对位置信息，我们绘制了中华鳖及其他进化上具有代表性的脊椎动物（人、小鼠、原鸡、爪蟾、斑马鱼）的gp130基因的共线性关系图（图4）。比较发现，gp130与邻近的4～5个基因存在保守的共线性关系，除个别物种外（如斑马鱼），该基因附近均可发现DDX4、IL31Ra、ANKRD55及MAP3K1等基因；同时与哺乳类与鸟类相比，没有发现基因错位与颠倒现象，但与爪蟾相比，gp130基因的编码方向发生了颠倒。

2.3 中华鳖gp130基因编码的蛋白特征、结构预测及系统进化树构建

图5为几种脊椎动物的GP130氨基酸全序列比对。构建的几种脊椎动物的系统发育树显示（图6），中华鳖GP130蛋白与西部锦龟首先聚类，其次是鸟类，然后与哺乳动物聚类，但与两栖类、鱼类等在进化上的距离较远。采用SOPMA在线软件预测结果表明，GP130蛋白的二级结构主要由α螺旋（17.80%）、延伸链（26.11%）、无规则卷曲（46.93%）、β转角（9.17%）组成。用SMART在线蛋白结构分析软件分析，发现该蛋白包含跨膜结构域、配体结合区、数个纤维链接蛋白（FN3）结构域。在SWISS-MODEL网站以人GP130为模型（PDB ID：3l5h.1.A），构建了中华鳖GP130蛋白的3D模型（图7），两者的一致性为58.32%。

图1 中华鳖gp130基因全长cDNA的PCR扩增验证

图2 中华鳖gp130基因全长序列

3 讨论

人类GP130首先获得克隆，是一个包含918个氨基酸残基的跨膜蛋白，相对分子质量为130× 103[15]。在鸟类及鱼类中也有相应报道[11，16]。本研究以中华鳖为研究对象，采用SMART RACE技术，获得了gp130基因的cDNA全长3806 bp，其中开放读框2784 bp，编码927个氨基酸残基。分析显示该序列含有许多功能结构：WSXWS序列，是造血细胞因子受体家族膜外部分受体与配体结合的关键序列[17]；血细胞生成素受体序列，是GP130家族特征结构；氨基酸序列末端还具有STAT3结合位点，该结构可促进与STAT3的结合，同时有助于激活STAT3[18]。在与中华鳖基因组比对时发现，gp130的基因组共跨越了16个内含子，总长近70 kb。同时分析比较了其他类型基因，发现比其他基因的内含子要长很多（结果未展示）。具体功能有待进一步探究。

图2 中华鳖gp130基因全长序列（续）

图3 中华鳖gp130基因与基因组DNA结构示意图

图4 几种脊椎动物gp130基因的共线性关系图

在比较了中华鳖与其他脊椎动物的gp130上下游4～5个基因的共线性关系后发现，在基因位置关系上，中华鳖与原鸡、小鼠、人很相近，并没有发现基因倒位或颠倒的现象；但在爪蟾中gp130的编码方向发生颠倒，与斑马鱼相比附近基因种类差异较大。这表明，在位置保守性上中华鳖更加接近于鸟类与哺乳类。同样，在进化树中也可以看到，中华鳖及锦龟GP130首先与原鸡聚类，其次是以小鼠和人为代表的哺乳类聚为一支，最后才是爪蟾与鱼类。这也表明，在进化关系上，爬行类的GP130进化关系更为接近鸟类与哺乳类，而非两栖类。这与传统观点一致[19]。

氨基酸序列分析表明我们获得的GP130不含信号肽，说明该蛋白不是分泌型蛋白。包含的二级结构主要为α螺旋、延伸链、无规则卷曲和β转角。通过蛋白三级结构分析，该蛋白含有配体结合区、跨膜结构域及FN3结构域。IL-6与其特异性受体IL-6R结合后使IL-6R发生构象变化，进而迅速与2分子信号转导蛋白GP130结合，导致GP130同源二聚体的形成[20]。GP130分子的二聚化使得与之偶联的JAK激酶相互接近，并通过交互的酪氨酸磷酸化作用而活化，进而磷酸化STAT3，激活下游通路[5，21]。采用同源建模法，以人GP130为模型预测了中华鳖GP130蛋白的3D结构，一致性为58.32%，两者的结构较为相似。说明该蛋白较为保守。

综上，我们克隆了中华鳖gp130基因cDNA全长，分析了其基因及蛋白结构，发现其在进化地位上更接近于哺乳类与鸟类。这为爬行动物的先天性免疫研究，特别是STAT信号通路相关研究奠定了基础。

图6 NJ法构建几种脊椎动物GP130氨基酸序列进化树

图7 中华鳖GP130蛋白3D模型

[1]张克英,唐君,方相春,等.JAK-STAT信号转导通路在神经系统疾病中作用的研究进展[J].神经解剖学杂志, 2014,30(2):237-240.

[2]Ip N Y,Nye S H,Boulton T G,et al.CNTF and LIF act on neuronal cells via shared signaling pathways that involve the IL-6 signal transducing receptor component gp130[J].Cell,1992,69(7):1121-1132.

[3]Scheller J,Kovaleva M,Rabe B,et al.Development of a monoclonal antibody-based enzyme-linked immunoabsorbent assay for the binding of gp130 to the IL-6/IL-6R complex and its competitive inhibition[J].J Immunol Methods,2004,291(1-2):93-100.

[4]Bollrath J,Phesse T J,von Burstin V A,et al. gp130-mediated Stat3 activation in enterocytes regulates cell survival and cell-cycle progression during colitis-associated tumorigenesis[J].Cancer Cell,2009,15 (2):91-102.

[5]林丽艳,张慧云,何韶衡.IL-6及其受体与炎症性疾病关系的新进展[J].中国热带医学,2008,8(4):680-682.

[6]刘徽,朱波,林治华.IL-6信号通路与肿瘤[J].细胞与分子免疫学杂志,2011,27(3):353-355.

[7]张腊娣,黄建安,於葛华.等.过敏性哮喘外周血细胞因子白细胞介素2、白细胞介素6及其受体的测定和临床意义[J].临床荟萃,2003,18(8):421-423.

[8]Kaneda M,Odaka T,Suetake H,et al.Teleost IL-6 promotes antibody production through STAT3 signaling via IL-6R and gp130[J].Dev Comp Immunol,2012,38 (2):224-231.

[9]Nishihara M,Ogura H,Ueda N,et al.IL-6-gp130-STAT3 in T cells directs the development of IL-17+Th with a minimum effect on that of Treg in the steady state[J].Int Immunol,2007,19(6):695-702.

[10]Klein C,Wüstefeld T,Assmus U,et al.The IL-6-gp130-STAT3 pathway in hepatocytes triggers liver protection in T cell-mediated liver injury[J].J Clin Invest,2005,115(4):860-869.

[11]Varela M,Dios S,Novoa B,et al.Characterisation,expression and ontogeny of interleukin-6 and its receptors in zebrafish(Danio rerio)[J].Dev Comp Immunol, 2012,37(1):97-106.

[12]Zhou F,Ding X Y,Feng H,et al.The dietary protein requirement of a new Japanese strain of juvenile Chinese soft-shelled turtle, Pelodiscus sinensis[J]. Aquaculture,2013,412-413(6):74-80.

[13]黄丽英,何中央,丁诗华,等.中华鳖种质资源的研究现状及保护、利用对策[J].宁波大学学报(理工版), 2005,18(2):183-186.

[14]Zhang Z,Niu C,Storset A,et al.Comparison of Aeromonas salmonicida resistant and susceptible salmon families:a high immune response is beneficial for the survival against Aeromonas salmonicida challenge [J].Fish Shellfish Immunol,2011,31(1):1-9.

[15]朱锦芳,郑仲承.细胞因子受体及其介导的信号转导[J].生命的化学,1996,(3):14-18.

[16]Schmitz J,Dahmen H,Grimm C,et al.The cytoplasmic tyrosine motifs in full-length glycoprotein 130 have different roles in IL-6 signal transduction[J].J Immunol,2000,164(2):848-854.

[17]Hibi M,Murakami M,Saito M,et al.Molecular cloning and expression of an IL-6 signal transducer, gp130[J].Cell,1990,63(6):1149-1157.

[18]Geissen M,Heller S,Pennica D,et al.The specification of sympathetic neurotransmitter phenotype depends on gp130 cytokine receptor signaling[J].Development,1999,125(23):4791-4801.

[19]郑光美.为什么近年有些教材将鸟类归入“爬行纲”[J]?生物学通报,2010,45(11):17-18.

[20]Kishimoto T,Akira S,Narazaki M,et al.Interleukin-6 family of cytokines and gp130[J].Blood,1995,86(4): 1243-1254.

[21]Taga T,Kishimoto T.Gp130 and the interleukin-6 family of cytokines[J].Immunology,1997,15(15):797-819.

Molecular Cloning and Bioinformatics Analysis of gp130 in Chinese Soft-Shelled Turtle（Pelodiscus sinensis）

SONG Ru-Xin,WANG Lan*,ZHANG Zuo-Bing*
School of Life Sciences,Shanxi University,Taiyuan 030006,China

Objective:To clone thegp130full-length cDNA from Chinese soft-shelled turtle.Methods:RACE PCR and bioinformation were used to clone the full-length sequence and predict thegp130gene and protein.Result:The length ofgp130cDNA of Chinese soft-shelled turtle was 3806 bp,encoding a 927 amino acid sequence and its genomic DNA length was 73 252 bp,which spans 16 introns and 17 exons.The BLAST results suggested that thegp130is a homolog of those of birds and mammalians.Bioinformatics analysis showed that the secondary structure consists ofα-helix,extension strand,random coil andβ-turn.The result of tertiary structure analysis showed that the protein contains ligand binding domain,trans membrane domains and FN3 domains.Phylogenetic analysis demonstrated that the reptilegp130clustered firstly with birds,and secondly with mammals,and finally with amphibians and fish.Meantime,we use the human GP130 protein as a model to construct the turtle GP130,the identity was 58.32%.Conclusion:We cloned thegp130full-length cDNA from Chinese soft-shelled turtle.This study laid a basement for further study ofgp130and the related signal pathways.

Pelodiscus sinensis;glycoprotein 130（GP130）;rapid amplification of cDNA ends（RACE）

Q78

A

1009-0002（2017）03-0265-09

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.03.006

2016-12-02

国家自然科学基金（31400343）

宋如昕（1992-），男，硕士研究生，（E-mail）srxsong@163.com

王兰，（E-mail）lanwang@sxu.edu.cn；张左兵，（E-mail）zbzhang@sxu.edu.cn

*Co-corresponding authors,WANG Lan,E-mail:lanwang@sxu.edu.cn;ZHANG Zuo-Bin,E-mail:zbzhang@sxu.edu.cn